Виживання та інфекційність метациклічних форм Trypanosoma cruzi в їжі

Виживання та інфекційність метациклічних форм Trypanosoma cruzi в експериментально забрудненій їжі

Нестор Аньєс *, Гладіс Крізанте та Максиміліано Ромеро

Паразитологічні дослідження Дж. Ф. Торреальба, Відділ біології, Факультет наук, Університет де Лос-Анд, Мерида, 5101, Венесуела. * Автор-кореспондент: [email protected]

Зафіксовано час виживання метациклічних форм Trypanosoma cruzi, отриманих із шлунково-кишкового тракту Rhodnius prolixus, на експериментально забрудненій їжі. Спостереження між 1 годиною та 18 годинами після забруднення виявили наявність рясних та активних метациклічних речовин у зараженій їжі протягом перших 6 годин, зменшуючи їх кількість приблизно на десяту годину. Активність метациклічних форм не показала відмінностей у їжі, забрудненій у твердій або рідкій фазі. Подібним чином демонструється висока зараженість метациклічними речовинами T. cruzi, які виживають у зараженій їжі після потрапляння в організм хребетних.

Ключові слова: Trypanosoma cruzi, метациклічна, забруднення, їжа, виживання, інфекційність.

Виживання та інфекційність метациклічних форм Trypanosoma cruzi в експериментально забрудненій їжі

Повідомляється про виживання метациклічних форм Trypanosoma cruzi у зараженій їжі. Спостереження, проведені через 1-18 годин після зараження їжі метациклічними речовинами від зараженого Rhodnius prolixus, виявили рясні та активні джгутики протягом перших 6 годин після зараження. Така ж активність спостерігалася у метациклічних речовин, що містяться на рідких або твердих забруднених продуктах харчування. Крім того, демонструється зараженість вижилими метациклічними формами T. cruzi у зараженій їжі після прийому хребетними хазяїном.

Ключові слова: Trypanosoma cruzi, метациклічна, контамінація, їжа, виживання, інфекційність.

Отримано 29.11.2008 Прийнято 11.03.2009

У попередній публікації, яка нещодавно з’явилася в цьому середовищі, Añez & Crisante (2008) зафіксували виживання культурних форм Trypanosoma cruzi в експериментально забрудненій їжі. У ньому автори зазначають, що у 73% зразків плодів та овочів, використаних у їх експериментах, паразити залишалися живими протягом 6–72 годин після забруднення, оцінюючи, також, найбільшу кількість живих джгутиків між 6:00. та 18:00. Незважаючи на те, що ці висновки стосуються неінфекційних форм паразита, використаний метод та отримані цікаві результати пропонують експериментальний варіант, який можна оцінити, використовуючи інфекційні форми від триатомінів, інфікованих T. cruzi. Цей підхід дозволить уявити, що може відбуватися в районах, де ендемічна хвороба Шагаса, коли триатоміни, інфіковані T. cruzi, колонізуючи будинки або вторгшись у них із джунглів або перидоміциліарного середовища, забруднюють їжу, яка залишається під впливом їх заражених фекалій. у побутовій сфері, всередині або поза домом, які нарешті потрапляють у різний час мешканцями одного і того ж.

Це дослідження досліджує виживання метациклічних форм T. cruzi, зібраних з експериментально заражених зразків Rhodnius prolixus, після зараження зразків фруктів, овочів, соків та рідкого молока фекальними матеріалами, отриманими з ректальної ампули. Подібним чином реєструється зараженість метациклічними речовинами T. cruzi, зібраними з одного із заражених продуктів харчування, піддаючи годуючих мишей пероральному прийому.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Ізольована від T. cruzi

Всі експерименти проводились із застосуванням ізоляту MHOM/Ve/92/2-92 T. cruzi, отриманого у важкому гострому випадку хвороби Шагаса з містечка Ла-Мапоріта, штат Барінас, Венесуела. Раніше його молекулярно характеризували як T. cruzi I (Añez et al., 2004). Цей ізолят підтримується в нашій лабораторії за допомогою періодичних проходів через експериментально інфіковані триатоміни та/або мишей.

Для проведення експериментів використовували дорослі зразки R. prolixus з колонії ентомологічної лабораторії Герман Лент, кафедра біології, факультет наук, Університет Лос-Анд, Мерида, Венесуела. Комахи були поглинені мишами, зараженими T. cruzi, що мають високі паразитомії. Після зараження триатоміни тримали в інкубаторі при температурі 25 ° C і відносній вологості повітря 70%, їх часто досліджували під мікроскопічним спостереженням зразків екскрементів, отриманих від кожної комахи, до виявлення метациклічних форм (рис. 1А). Після підтвердження зараження комах розтинали, отримуючи вміст ампули прямої кишки, щоб потім мікроскопічно підрахувати паразитів, щоб оцінити кількість метациклічних форм на об’єм (рис. 1Б).

У експериментах використовували фрукти та овочі у шматках розміром 3 х 3 см або подрібнених для отримання їх соків, а також кокосову воду та рідке молоко, розлиті у ½ літрові ємності. Зразки фруктів включали банан, диню та лечозу у двох їхніх презентаціях у шматочках та у соках, тоді як з овочів у обох формах був представлений лише помідор, оскільки картопля та морква, обидва варені, розміщувались у шматочках зазначеного розміру. Зразок моркви було вилучено через високе початкове забруднення. Зразки по шматочках поміщали в пластикові контейнери (лунка TC-Plate 6, стерильна клітинна зірка) діаметром 3,5 см у кожну лунку, належним чином відокремлювали і покривали (рис. 2). Зразки соку, кокосової води та молока зберігали у стерильних пластикових флаконах об’ємом 5 мл із загвинченою кришкою.

Після того, як інфіковані тріатоміни були розкриті, пул вмісту кишечника спостерігали в мікроскопі Аксіоскоп (Zeiss) з об'єктивом фазової контрастності в 400x для виявлення та оцінки кількості метациклічних речовин T. cruzi, присутніх за обсягом (рис. 1B). Отриману концентрацію метациклічних речовин оцінювали у 200/мл, кожному зразку розподіляли об’єм 25 мкл, що еквівалентно 5x10 3 метациклічним речовинам на забруднений зразок (рис. 2). Спостереження за зразками проводили через 1, 3, 6, 10 та 18 годин після зараження метациклічними T. cruzi. Вони полягали у взятті аликвоти приблизно 5 мкл градуйованою піпеткою Гілсона з наконечником фіксованого об’єму після обережного струшування зразка, після чого приступили до розміщення його на предметному склі для мікроскопічного дослідження, як зазначено вище. Наявність паразитів у кожній пробі було якісно зареєстровано, як зазначено в попередній публікації (Añez & Crisante, 2008). Подібним чином активність метациклічних форм у позитивних зразках реєстрували за допомогою цифрової відеокамери (Noticam 480), пристосованої до мікроскопа Axioscop і підключаної до комп'ютера HP за допомогою програми Motic Images 2000 Версії 1.3.

Тест на зараженість метациклічних речовин проводили, використовуючи лише заражені зразки молока, отримані в аліквотах по 50 мл через 1, 3 та 6 годин після забруднення. Кожен отриманий таким чином зразок пропонували перорально парі мишей-сисунів віком 5 днів кожного разу (рис. 3). Зразки крові від кожної миші мікроскопічно досліджували між 7 і 24 днями після посіву посіву, що містить вижилі метациклічні речовини, з метою вивчення їх інфекційної здатності. Спостереження проводили в двох примірниках на свіжих препаратах крові, взятих з хвоста кожної миші, і на мазках зразків крові, закріплених і забарвлених 10% плямою Гімзи у фосфатному буфері, рН 7,2. Крім того, з цією ж метою зразки серця деяких заражених мишей піддавали специфічному ПЛР-аналізу на ДНК T. cruzi (Sturn et al., 1989; Guhl et al., 2002).

Виживання метациклічних речовин Trypanosoma cruzi в експериментально забрудненій їжі.

Мікроскопічні спостереження, проведені між 1 год і 18 год на зразках їжі, раніше забруднених метациклічними речовинами T. cruzi, виявили присутність цих джгутиків у всіх формах представлення фруктів, овочів та рідин, демонструючи активні рухи та переміщення, подібні до виявлених у вихідний посівний матеріал із вмісту кишечника, присутній в ампулі прямої кишки R. prolixus. Загалом, протягом перших 6 годин спостереження майже у всіх зразках було відзначено велику кількість активних метациклічних речовин, які зменшувались приблизно через 10 годин після забруднення. Спостереження, що відповідало годині 18, показало активність, яку можна було зареєструвати в метацикліках лише у зразку кокосової води; решта зразків на той час були сильно забруднені бактеріями, виявляючи лише мертвих паразитів у деяких з них. У таблиці I детально описуються результати запису про виживання метациклічних речовин у різних заражених харчових продуктах, включаючи форму подання зразка та активність, виявлену протягом усього періоду спостереження.

Інфекційність метациклічних Т. cruzi зібране із зараженого молока