Науковий студентський гурток VARGA VIKTÓRIA EVELIN Визначення вмісту яєць у сухих тістах методом ІФА Науковий керівник: Зсузанна Еке, к.т.н., кафедра аналітичної хімії Технологія розділення Дослідницька та навчальна лабораторія Науковий факультет Університету Етвеша Лоранда Будапешт, 2011-1 -

сухих

Зміст 1. Вступ. 3 2. Огляд літератури. 4 2.1 Склад яйця. 4 2.1.1 Яєчний білок. 4 2.1.2 Яєчний жовток. 4 2.2 Визначення вмісту яєць у сухих макаронах. 5 2.2.1 Визначення вмісту холестерину. 5 2.2.2 Визначення білка яєць. 6 2.2.3 Методи змішування. 7 2.3 ІФА. 7 3. Завдання. 11 4. Експериментальна частина. 12 4.1 Матеріали та інструменти. 12 4.1.1 Комплект ІФА. 12 4.1.2 Інші використовувані інструменти. 12 4.1.3 Зразки. 13 4.1.3 Виготовлення тіста. 14 4.2 Підготовка проби. 15 4.3 Процедура випробування. 17 4.4 Оцінка результатів. 17 5. Власні результати. 19 5.1 Домашні макарони. 19 5.2 Магазин випічки. 20 5.3 Тісто, виготовлене з різних яєць. 22 5.5 Проблеми з сухими макаронами з високим вмістом яєць. 26 Подяка. 30 Список використаної літератури. 31-2 -

1. Вступ Згідно з правилами Угорської харчової книги (MÉK), сухі макарони можуть бути виготовлені з меленого Triticum aestivum (звичайна пшениця) або Triticum durum (тверда пшениця), з яйцями або без них, з додаванням води та, можливо, іншого харчові добавки [1]. Якість, фізичні та приємні властивості макаронних виробів, виготовлених з використанням яєць, залежать головним чином від їх вмісту в яйцях, а також яйця містять багато мінеральних речовин, важливих для людського організму. Тому для покупців дуже важливо знати, що вони насправді купують суху макаронну заготовку тієї якості, яка вказана на упаковці. Тому з точки зору контролю якості важливо мати можливість точно визначати вміст яєць у цих продуктах за допомогою відповідних аналітичних методів. Макарони, виготовлені з використанням яєць згідно з Угорською книгою продуктів харчування [1], вимагають щонайменше стільки яєць, скільки одне яйце в цьому випадку означає 45 г яєць без шкаралупи - вони повинні містити на кг сухих макаронних виробів, кількість яєць у макаронах становить вказаний на упаковці. Розробка достатньо точного аналітичного методу для підтвердження цього є проблемою сьогодні. - 3 -

2. Огляд літератури 2.1 Склад яєць Яйця, за винятком вітаміну С, містять усі поживні речовини, необхідні людському організму. В основному він складається з трьох частин: яєчної шкаралупи (

60%) та яєчний жовток (

Рисунок 1: Лоток для тримача комірок на 16x8 місць. На малюнку 17 знімних комірок. Під час ІФА сендвіч (рис. 2) антитіла, специфічні для антигену, тобто аналіту у зразку, фіксуються на поверхні твердої фази в кожній лунці в однаковій кількості. Після додавання зразка антигени, що підлягають виявленню, специфічно зв’язуються з антитілами. Потім інші незв’язані надлишки компонентів зразка зазвичай видаляють промиванням. Після цього додається друге ферментно-зв’язане антитіло, яке специфічно зв’язується з іншим епітопом антигену (сайтом зв’язування антитіл молекули антигену). Таким чином, наш антиген буде затиснутий між цими двома антитілами. Нарешті, додається хромогенний субстрат для ферменту, приєднаного до другого антитіла, ферментативна конверсія якого супроводжується зміною кольору. В кінці реакція зупиняється слабкою кислотою з подальшим фотометричним вимірюванням. Чим більше антигену містила наша проба, тим сильніше отримували колір, тому вимірюваний сигнал буде пропорційний концентрації вимірюваної речовини у зразку. Кількісне визначення проводиться на основі стандартної кривої, отриманої із серії розведення розчину з відомою концентрацією цільової молекули. - 8 -

Значення, отримані за допомогою ІФА для визначення білків із складних харчових матриць, можуть бути дуже перекошеними. Причин цьому може бути кілька. Помилково негативні результати можуть мати місце при неправильному витяганні з харчової матриці. ІФА придатний лише для виявлення інтактних білків, тому, якщо білок, навіть хоча і обмежений, гідролізується, імунореактивність ІФА щодо нього може бути втрачена. Білки, що підлягають визначенню, та їх епітопи, важливі для ІФА, можуть бути хімічно модифіковані в деяких продуктах харчування під час переробки їжі, що також може призвести до зниження імунореактивності тесту [29]. Білок, що підлягає виявленню, може взаємодіяти з іншими компонентами харчової матриці. Це може спричинити зниження імуногенності, і тому не виявляється. Інші компоненти харчової матриці також можуть перехресно реагувати з антитілами, специфічними для виявлених білків, що призводить до помилково позитивного результату. Сухі макарони - це відносно проста харчова матриця (див. Розділ 1). Отже, ймовірність можливих перехресних реакцій компонентів матриксу та взаємодії з білками, які будуть виявлені, є значно нижчою. - 10 -

3. Завдання В Угорщині досить точний аналітичний метод визначення вмісту яєць у сухих макаронах досі залишається проблемою. Однак зрозуміло, що будь-який аналітичний метод, придатний для цієї мети, повинен базуватися на вимірюванні специфічного для яйця компонента. ІФА часто використовується для визначення вмісту яєчного білка в продуктах. Цей метод простий, чутливий і дуже конкретний. Він легко стандартизується та автоматизується, дозволяючи тестувати великі обсяги зразків. Тому моєю метою було з’ясувати, використовуючи стандартизований набір ІФА для визначення яєчних білків з різних продуктів харчування, що ІФА, характерний для більш ніж одного яєчного білка, може бути придатним для визначення вмісту яєць у цих сухих макаронах. - 11 -

повністю висохнути. Після того, як я повністю висушив тіста, я зважив їх точну вагу по одному. У кожному випадку я перерахував вміст яєць на 1 кг з точної ваги яєць після сушіння та під час приготування. Вміст яєць давали в кожному випадку в кількості шматочків, де один шматок яйця означає 45 г яєць без шкаралупи. 4.2 Приготування зразків Перед використанням екстракційний буфер, отриманий у вигляді 10-кратного концентрату, спочатку поміщають на водяну баню при 37 o C на кілька хвилин для розчинення будь-яких наявних кристалів, а потім гомогенізують, добре струшуючи. Потім я розбавив у 10 разів дистильовану воду. - 15 -

як функція. Я підставив квадратичну лінію до показаних точок, а потім розрахував виміряний вміст яєць у тістах на основі рівняння цієї лінії. - 18 -

Концентрація (ppm) між концентрацією яєчного білка та вказаним вмістом яєць не може бути встановлена ​​прямо на показаних точках. Також було виміряно три різних типи тіста з 8 яєчних тістів, і три з цих 8 тістових яєць було виміряно (S8b/1, S8b/2, S8b/3). РСД% концентрації яєчного білка, отриманого в результаті повторних вимірювань 8-яєчного тіста, складало 1,09%. РСД%, розраховане за результатами концентрації яєчного білка у всіх 8 яєчних локшинах, що також включає надзвичайно низьку вартість локшини з восьми яєчних локшини, хоча 10,73% 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 Вміст яєць (шт) Рисунок 5: На основі значень поглинання запасних тістів, наведених у таблиці 1, концентрація яєчного білка, розрахована за допомогою програмного забезпечення Ridawin, будується як функція від вмісту яєць у кожному тісті. - 21 -

вони змінюються до такої міри, що істотно змінюються. Однак вміст білка в яйцях з різних місць може сильно відрізнятися. Хоча ELISA сам по собі не виявився придатним методом для визначення вмісту яєчного білка в сухих макаронах, разом із вимірами інших складових яєць, коли використовується у комбінованому методі, він все ще може відігравати важливу роль у визначенні вмісту яєць у сухих макарони. - 29 -

Подяка Я хотів би подякувати доктору Зсузанні Еке за численну допомогу та корисні поради, які вона надала при підготовці моєї дисертації. - 30 -

[24] Ľ. Земкова, Й. Сімеоновава, М. Лиховникова, К. Сомерлікова, чеська J. Anim. Sci., 52 (2007) 110-115. [25] Ф. Кваснічка, Електрофорез, 24 (2003) 860-864 [26] Н. Шнайдер, К. М. Беккер, М. Пішецрідер, Й. Хром. Б, 878 (2010) 201-206. [27] Z. H. Reed, J. W. Park, Food Chem., 118 (2010) 575-581 [28] Y. Watanabe, K. Aburatani, T. Mizumura, S. Muraoka, J. Imm. Методи, 300 (2005) 115-123 [29] С. Л. Тейлор, Дж. А. Нордлі, Л. М. Німан, Анал. Біоанал. Chem., 395 (2009) 83-92 [30] C. D. Amigo, Anal. Біол. Chem., 3 (2010) 344-350-32 -