Предмети

Резюме

Вступ

Exendin-4 (Ex-4), новий протидіабетичний засіб, виділений із слинних залоз монстра Гіла, має 53% гомологію з людським глюкагоноподібним пептидом-1 (GLP-1) і в першу чергу призначений для поліпшення контролю рівня глюкози діючи на глюкагоноподібний рецептор пептиду-1 (GLP-1) (GLP-1R) 16. Однак нещодавно дослідники виявили, що Ex-4 також сприяє проліферації або виживанню багатьох типів клітин 17, 18 через GLP-1R-залежні та незалежні 19, 20 шляхи. Однак мало відомостей про вплив Ex-4 на біологічні функції MSC. У цьому дослідженні ми спостерігали сприятливий вплив Ex-4 на проліферацію, міграцію та виживання MSC. Далі ми дослідили, чи модулююча функція Ex-4 в MSC зумовлена ​​активацією сигнального шляху PI3K/Akt.

Матеріали і методи

Заява з етики

Це дослідження було проведено відповідно до Гельсінкської декларації та керівних принципів Комітету з етики Загальної лікарні Народної армії свободи Китаю (Пекін, Китай). Усі експериментальні протоколи були схвалені Комітетом з етики Загальної лікарні Народної армії свободи в Пекіні (Китай).

Виділення, посів та ідентифікація кісткового мозку MSC.

MSC виділяли з кісткового мозку і збирали, як описано вище. Коротко, зразки кісткового мозку щурів Sprague-Dawley розбавляли PBS і центрифугували при 400 xg протягом 30 хв. Буйний шар, що містить мононуклеарні клітини, двічі промивали PBS і висівали в культуральне середовище MSC, що складається з модифікованого середовища орла Дульбекко (DMEM; Invitrogen Co., USA) з L-глутаміном і 10% (об/об) фетальної бичачої сироватки (FBS) ). Культури витримували при температурі 37 ° C у зволоженій атмосфері, що містить 5% вуглекислого газу. Через 24 год неприклеєні клітини викидали і додавали свіже середовище та замінювали кожні 4 дні. Кожну первинну культуру пересівали у співвідношенні 1: 2, коли MSC досягав приблизно 80% злиття.

Для адипогенної та остеогенної диференціації використовували середовище адипогенезу та диференціації остеогенезу StemPro® (Invitrogen Co., USA) відповідно до протоколу виробника. Культури оновлювали кожні 2-3 дні. Після 3 - 4 тижнів культури оцінювали адіпогенез, інкубуючи клітини розчином Олійно-червоного О для фарбування нейтральних ліпідів у цитоплазмі. Alizarin Red S (Sigma-Aldrich, USA) використовували для оцінки остеогенної диференціації.

Для підтвердження характеристики MSC клітини, вирощені в пасажі 3, піддавали проточній цитометрії з використанням маркованих FITC маркерів CD29, CD31, CD34, CD45, CD90, CD105 та CD166 (BD Biosciences, США). Концентрації, рекомендовані виробником. Клітини, пофарбовані міченим FITC IgG, використовували як негативний контроль. Аналіз використовував FACScan для щонайменше 10 000 подій за допомогою програмного забезпечення CellQuest.

Аналіз життєздатності клітин

Життєздатність клітин MSC оцінювали за допомогою аналізу броміду 3- (4,5-диметилтіазол-2-іл) -2,5-дифенілтетразолію (MTT; Sigma-Aldrich, США). Коротко, MSC висівали в 96-лункові планшети. Після обробки різними дозами Ex-4 (0-20 нм/л, Sigma-Aldrich) протягом 12 годин клітини інкубували з розчином МТТ (Sigma-Aldrich) при 37 ° C протягом 4 годин. Потім середовище видаляли і до кожної лунки додавали 100 мкл диметилсульфоксиду (DMSO). Поглинання вимірювали при довжині хвилі 570 нм. Дані виражаються як відношення між значенням оптичної щільності (OD) обробленої групи та OD контрольної групи.

Проточна цитометрія

Експресію CXCR4, швидкість апоптозу та розподіл клітинного циклу MSC оцінювали за допомогою проточної цитометрії. Після обробки різними концентраціями Ex-4 (0-20 нм/л) протягом 24 год MSC використовували при P 3 для виявлення експресії CXCR4. Після промивання в PBS кожну групу клітин фарбували міченим FITC CXCR4 (Bioss, Китай) або міченим FITC IgG протягом 30 хвилин при кімнатній температурі.

Кількість апоптотичних клітин кількісно аналізували за допомогою набору для виявлення апоптозу Annexin V - FITC/PI (BD Biosciences, США). Після обробки клітини збирали, ресуспендували в 200 мкл зв’язуючого буфера, а потім інкубували з 5 мкл суміші Анексину V-FITC/буфера зв’язування (30 хв, 37 ° С) у темряві. Потім клітини інкубували з 10 мкл йодиду пропідію протягом 5 хвилин і негайно аналізували за допомогою двовимірної проточної цитометрії за допомогою цитометра BD FACSCalibur.

Для аналізу клітинного циклу MSC обробляли Ex-4 (0-20 нм/л) протягом 24 годин. Потім клітини ресуспендували в PBS і фіксували холодним 70% етанолом протягом 24 годин. Фіксовані клітини промивали і ресуспендували в 50 мкг/мл йодиду пропідію протягом 30 хвилин у темряві. Аналізи проточної цитометрії проводили за допомогою цитометра BD FACSCalibur.

Аналіз клітинної проліферації

Проліферацію клітин оцінювали за допомогою набору для підрахунку 8 клітин (CCK-8) (Інститут біотехнологій Бейотіме, Китай) та аналізу проліферації 5-етиніл-2'-дезоксиуридину (EdU) (RiboBio Co., Китай). Для тесту CCK-8 клітини висівали в 96-лункові планшети (5 × 10 3 клітин/лунку) з Ex-4 (0–20 нм/л) у триразовому зразку. Аналізи проводили через 1 - 7 днів після посіву шляхом додавання 100 мкл свіжого середовища в 10 мкл розчину CCK-8 протягом ще 2 годин при 37 ° C. Вимірювали OD при 570 нм. Тест повторювали 3 рази.

Аналіз EdU (RIBOBio Co, Гуанчжоу, Китай) використовували для вимірювання здатності клітин до проліферації після обробки 20 нм Ex-4 протягом 24 годин. Після інкубації з EdU протягом 2 год клітини фіксували 4% параформальдегідом і пронизували 0,5% Triton X-100. Потім реакційний коктейль Apollo® (флуоресценція та реакційний буфер Apollo® 643) додавали до середовища ще протягом 30 хвилин у темряві. Після промивання PBS 3 рази клітини фарбували DAPI (Sigma-Aldrich) протягом 5 хвилин і негайно спостерігали під флуоресцентною мікроскопією. Кількість клітин EdU + розраховували шляхом підрахунку принаймні трьох випадково розділених полів.

Вестерн-болтовий аналіз

Аналізи міграції та загоєння ран.

Аналіз міграції MSC проводили з 24-лунковою камерою Transwell з розміром пор 8 мкм (Корнінг, США). Спочатку MSC культивували Ex-4 (0-20 нм/л) протягом 24 год; потім 10 5 MSC висівали у верхню камеру в безсироваткове середовище. Фактор 1а, отриманий із стромальних клітин (SDF-1, Sigma-Aldrich, 50 нг/мл), додавали в нижню камеру. Після 12-годинної інкубації при 37 ° С немігруючі клітини у верхній камері обережно видаляли ватним тампоном, а клітини, що пройшли через мембрану, фіксували в метанолі та фарбували 0 кристалічно-фіолетовим. 05%. Для кількісного визначення кількість мігруючих клітин розраховували шляхом підрахунку принаймні п'яти окремих випадкових полів як відношення експериментальних зразків до контрольних зразків х 100.

Для аналізу загоєння ран 10 6 клітин висівали в пластини розміром 36 мм і культивували до злиття 80–90%. Штучна рана була створена за допомогою наконечника піпетки Р200, щоб подряпати моношар злитих клітин. Фотомикрофотографії отримували негайно (час 0 год), а потім клітини інкубували в DMEM, що містить 1% фетальної бичачої сироватки з Ex-4 або без неї протягом 24 годин. Через 24 год спостерігали мобілізацію клітин та закриття рани подряпинами.

Індукція окислювальних стресових травм та тест TUNEL

Апоптоз оксидативного стресу при МСК був викликаний перекисом водню та депривацією сироватки. Коротко, середовище MSC замінювали без сироватки DMEM, доповненою 0,3 мМ H2O2, і MSC інкубували при 37 ° C в нормоксичних умовах протягом 12 годин. Для експериментів із захистом Ex-4 MSC попередньо обробляли Ex-4 (0-20 нМ) протягом 12 год; потім середовище викидали і замінювали безсироватковою DMEM, доданою 0,3 мМ H2O2, ще протягом 12 годин. Дезоксинуклеотидилтрансфераза, опосередкована аналізом маркування dUTP-біотину в кінці виїмки (TUNEL), використовувалась для виявлення апоптозу MSC під H 2 O 2 згідно з протоколом виробника. Ступінь апоптозу обчислювали як кількість TUNEL-позитивних клітин на 500 ядер MSC. Ядра фарбували хроматиновим барвником DAPI. Коротко кажучи, клітини фіксували протягом 1 години у 4% (мас./Об.) Параформальдегіду при кімнатній температурі. Після специфічного мічення клітини піддавали дії DAPI в темряві протягом 5 хв. Потім імунозабарвлені МСК спостерігали за допомогою флуоресцентної мікроскопії.

Активність Caspase3, ROS, MDA, SOD, GSH та GPX.

Оскільки активація каспази 3 є важливим етапом в процесі апоптозування, для виявлення активності каспази 3 згідно з протоколом виробника був використаний набір активності каспази3 Ac-DEVD-AMC (Інститут біотехнології Бейотіме, Китай). Відносну активність каспази3 розраховували як відношення викидів від оброблених клітин до необроблених клітин. Тест повторювали 3 рази.

Для виявлення внутрішньоклітинних АФК використовували дигідроетидій (DHE; Invitrogen, Німеччина), а 10 мкМ DHE додавали до середовища для культивування клітин, яке потім інкубували в темряві та спостерігали під конфокальною лазерною мікроскопією (Olympus).

Малондіальдегід (МДА) є кінцевим продуктом перекисного окислення ліпідів, що виникає в результаті окисного пошкодження, і є надійним маркером рівня пошкодження MSC, спричиненого H 2 O 2. Глутатіон (GSH), глутатіонпероксидаза (GPX) та супероксиддисмутаза (SOD) є важливими антиоксидантами, які беруть участь у ефективному виведенні вільних радикалів та у придушенні дії окисного стресу, що сприяє виживанню MSC під впливом H2O2. Вміст MDA, активність SOD/GPX та концентрацію GSH вимірювали за допомогою комерційних наборів (Інститут біотехнологій Бейотіме, Китай), дотримуючись інструкцій виробника.

Реактивне лікування

Для вивчення ролі шляху PI3K/Akt у опосередкованій Ex-4 проліферації, міграції та виживанні MSC, LY294002 (20 мкм/л, технологія сигналізації клітин) додавали до середовища MSC протягом 4 годин перед обробкою Ex -4 до блокувати активацію шляху PI3K/Akt. Для експериментів з проліферацією (аналіз клітинного циклу та аналіз EdU) MSC обробляли Ex-4 протягом 24 годин до вищезазначених аналізів. Для аналізу хемотаксису MSC культивували Ex-4 протягом 24 годин, а потім висівали в камери хемотаксису протягом 12 годин. Крім того, для блокування взаємодії між CXCR4 та SDF-1α, MSC інкубували з антитілом CXCR4 або без нього (AMD3100, Abcam, США, 10 мкг/мл) протягом 2 годин перед обробкою Ex-4 (20 нм/л). У моделі апоптозу, індукованої H 2 O 2, MSC попередньо обробляли Ex-4 (0–20 нм/л) протягом 12 годин, а потім інкубували з 0,3 мМ H 2 O 2 протягом 12 годин.

Статистичний аналіз

Результати показані як ± SD щонайменше 3 повторень. Для групових порівнянь був проведений односторонній ANOVA з пост-hoc корекцією Шеффе з використанням SPSS 17. Значення P

вплив

( ДО ) Результати проточної цитометрії продемонстрували, що МСК були рівномірно негативними для CD31, CD34 та CD45 та позитивними для експресії CD29, CD73, CD90, CD105 та CD166. ( B ) Ізольований МСК виявляв форми, подібні до фібробластів, і демонстрував множинні можливості диференціювання. Брусок, 25 мкм.

Повнорозмірне зображення

Вплив Ex-4 на життєздатність клітин MSC та шлях PI3K/Akt

Спочатку ми оцінили, чи сам Ex-4 мав токсичну дію на MSC. Як показано на рис. 2А, у всьому діапазоні використовуваних концентрацій (1–20 нМ) Ex-4 мало впливав на життєздатність клітин у порівнянні з необробленими клітинами, вказуючи на те, що Ex-4 не мав токсичного впливу на MSC.

MSC інкубували з різними дозами Ex-4 протягом 24 годин. Його життєздатність оцінювали за допомогою МТТ, а активацію шляху PI3K/Akt - за допомогою Вестерн-блот. ( ДО ) Ex-4 не мав токсичного впливу на MSC. ( B ) Ex-4 активував Akt залежно від дози. * P # P 21, які опосередковують класичні сигнали зростання та виживання в MSC 22. Тому ми досліджуємо вплив Ex-4 на шлях PI3K/Akt в MSC. Як показано на рис. 2В, обробка Ex-4 підвищувала рівень фосфорильованого Akt (p-Akt) залежно від концентрації. Однак у присутності інгібіторів PI3K/Akt експресія p-Akt була сильно пригнічена, вказуючи на те, що Ex-4 був активатором вищого напрямку PI3K/Akt у MSC.

PI3K/Akt, необхідний для розмноження, спричиненого Ex-4

Щоб встановити роль Ex-4 у зростанні MSC, змінні дози Ex-4 додавали до культурального середовища протягом 24 годин, а потім аналізували розподіл клітинного циклу за допомогою проточної цитометрії. Як показано на рис. 3A, B, підвищена частка клітин із групи Ex-4 знаходилась у фазах S та G 2/M, а менша кількість клітин знаходилась у фазі G 1 циклу, що свідчить про те, що Ex-4 викликав дозозалежне збільшення кількості клітин, що діляться. Для подальшого підтвердження того, чи сприятиме стимулювання клітинного циклу Ex-4, збільшить тривалість життя клітин, вплив Ex-4 на конкретну кінетику росту MSC оцінювали за допомогою CCK-8. Криві зростання, показані на рис. 3C, показали, що здатність до зростання MSC поступово покращувалась із збільшенням концентрації Ex-4. Однак інгібування PI3K/Akt пригнічувало ці ефекти Ex-4 на проліферацію MSC. Крім того, між контрольною групою та групою 1 нМ не було суттєвих відмінностей, і протягом перших 24 годин значних відмінностей між групами не виявлено.

Ex-4 покращена експресія CXCR4 і подальша міграція MSC через PI3K/Akt

SDF-1α та його унікальний рецептор CXCR4 відіграють ключову роль у мобілізації та наборі МСК у пошкодженій серцевій тканині після трансплантації. У нашому дослідженні ми виявили незначну експресію CXCR4 в нормальних MSC, тоді як Ex-4 підвищував рівень білка CXCR4, який досяг піку при 20 нМ Ex-4 (рис. 4А). Крім того, підвищення регуляції внутрішньоклітинних рівнів експресії CXCR4 призвело до збільшення експресії на поверхні клітин, про що свідчить більша кількість CXCR4-позитивних клітин у групі Ex-4, ніж у контрольній групі (18,46 ± 1,33% у групі 20 нМ проти 1,31 ± 0,32% у нормальній групі, Р

Обговорення

Докази 33, 34, 35 накопичені щодо ролі трансплантатів МСК у лікуванні інфаркту міокарда внаслідок їх заміщення міокарда, кардіопротекторних та кардіотрофічних ефектів 36. Незважаючи на спостережувані сприятливі ефекти клітинної терапії, утримання 37, виживання 7 та функціональність прищеплених клітин 38 все ще мають бути покращені. Повідомляється, що 99% трансплантованих клітин втрачаються після трансплантації 39, 40 внаслідок апоптозу клітин, депривації поживних речовин та запальної реакції 41. Крім того, відсутність торгівлі клітинами та/або референтних факторів у трансплантованих клітинах сприяє "вимиванню" прищеплених клітин від серця та їх міграції до віддалених органів 9. У той же час ми спостерігали, що кількість МСК в кістковому мозку дуже низька, а їх здатність до автоматичного оновлення обмежена, особливо в мікросередовищі з важким проживанням 5, 42, що представляє критичну проблему: як отримати достатню кількість кількість клітин для пересадки. Тому ми досліджували вплив Ex-4 на проліферацію MSC, міграцію та індукований H2O2 апоптоз.

Додаткова інформація

Як цитувати цю статтю: Zhou, H. et al. Вплив Exendin-4 на проліферацію, міграцію та апоптоз мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку in vitro. Науковий співробітник. 5, 12898; doi: 10.1038/srep12898 (2015).

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов та правил спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, позначте це як неприйнятне.