гепатиту

  • предметів
  • реферат
  • Передумови:
  • методи:
  • результати:
  • висновок:
  • Головний
  • Матеріали і методи
  • Пацієнти, гістопатологічна оцінка та спостереження
  • Кількісні внутрішньопечінкові вимірювання HBV ДНК та cccDNA
  • Аналіз експресії генів за допомогою РНК-послідовності
  • Статистичний аналіз
  • Затвердження дослідження
  • результат
  • Характеристика вірусного навантаження HBV на пухлину та парні непухлинні печінки
  • Більша кількість копій cccDNA у менших пухлин порівняно з більшими пухлинами
  • Внутрішньопечінкове вірусне навантаження та вірусна активність на основі сироваткової ДНК HBV та HBeAg
  • Вплив активності реплікації вірусу в пухлині та новоутвореній печінці на виживаність пацієнта та рецидив HCC
  • Експресія генів, пов'язана з активністю реплікації вірусу в неопухолевій печінці
  • Вірусний генотип та варіанти пухлинної та новоутвореної тканини печінки
  • обговорення
  • Історія змін
  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаткові матеріали та методи
  • Файли PDF
  • Додаткові таблиці 1-8

предметів

  • Реплікація ДНК
  • Жовтяниця типу В
  • Гепатоцелюлярна карцинома
  • Інфекції вірусом пухлини

Ця стаття оновлена

реферат

Передумови:

Мета цього дослідження полягає у визначенні ефекту внутрішньоклітинної ДНК вірусу гепатиту В (HBV), ковалентно запечатаної циркулярної ДНК (cccDNA) та активності реплікації вірусів як у пухлині, так і в неопухолевій печінці на прогноз та визначити взаємозв'язок між активністю реплікації вірусу та фіброз Ісхака. при прогнозуванні результату після резекції.

методи:

Включено 99 потенційно зарахованих пацієнтів, які отримували первинну резекцію печінки для HBV-HCC. Внутрішньоклітинна ДНК HBV і cccDNA визначалася кількісно за допомогою ПЛР у режимі реального часу. Секвенування РНК (RNA-seq) проводили у підгрупі з 21 пацієнта, які мали або мінімальний фіброз печінки (стадії Ішака 0-2), або фіброз кінцевої стадії (стадія Ішака 6).

результати:

Тканина пухлини містила нижчі копії cccDNA порівняно з парними неопухолевими печінками, а більші пухлини (> 3 см) мали менше cccDNA порівняно з малими пухлинами (-3 cm). Висока активність вірусної реплікації в новоутвореній печінці була пов’язана з більш високим рівнем рецидивів HCC незалежно від стадії фіброзу Ішака. Гени, які корелювали з реплікативною активністю вірусу в неопухолевій печінці (620 генів), відрізнялися від генів, асоційованих з кінцевою стадією фіброзу (1226 генів). Гени, асоційовані з реплікативною активністю вірусів, переважно розподілялися в областях chr3, chr16 та chr19.

висновок:

Активність реплікації вірусу в новоутвореній печінці пов'язана з рецидивом HCC за допомогою механізмів, які відрізняються від стадії фіброзу Ішака і не залежать від стадії фіброзу Ішака.

Головний

Вірус гепатиту В (ВГВ) - це оболонковий вірус ДНК, який переважно інфікує гепатоцити. У випадку зрілого віріона вірусна ДНК присутня у звільненій круговій формі (rcDNA), яка є частково дволанцюжковою. Після потрапляння в клітину-хазяїн вірусний геном транспортується до ядра, де ркДНК перетворюється на ковалентно герметичну циркулярну ДНК (cccDNA) (Levrero et al, 2009). Отримавши форму, вміст cccDNA є стабільним у спокійних гепатоцитах і може бути зменшений шляхом розведення шляхом ділення клітин, вбивства інфікованих клітин або придушення противірусними цитокінами (Belloni et al, 2012).

Постійна інфекція HBV є основним фактором ризику розвитку гепатоцелюлярної карциноми (HCC), асоційованої з HBV. Вірусні білки, інтеграція вірусного геному в геном хазяїна, запалення, окислювальний стрес та тривалі фіброзні реакції, пов'язані з хронічною інфекцією HBV, можуть відігравати всю важливу роль у гепатокарциногенезі (Xu et al., 2010; Zhou et al., 2010; Arzumanyan Наші попередні дослідження показали, що кінцева стадія фіброзу (фаза 6 Ісхака) незалежно пов'язана з поганою загальною виживаністю та більш високим рівнем рецидивів HCC (Wang et al., 2013b, 2013c) та ін., 2010). Крім того, наше попереднє дослідження з використанням неінотластичних зразків тканини печінки, вбудованих у парафін, від 111 пацієнтів з HBV-HCC, пролікованих між 1991 і 2008 рр., Показало, що активність реплікації вірусу, як свідчить частка cccDNA у загальній ДНК HBV, корелює з некротичним запаленням та Фіброзна стадія Ісхака і те, що висока реплікаційна активність вірусу в новоутвореній печінці була пов’язана з поганим результатом у пацієнтів з HBV-HCC (Wang et al, 2013c).

Метою цього дослідження є визначити, чи не впливає ефект реплікації вірусу HBV на результат через механізми, незалежні від фіброзу, або вторинні. У цьому звіті описуються результати перспективної когорти пацієнтів, які абсолютно відрізняються від попередньої ретроспективної когорти. У це дослідження включені лише дані, отримані зі зразків свіжої тканини, отриманих від пацієнтів із первинною резекцією печінки, залучених до дослідження в період з 2008 по 2013 рр. Внутрішньоклітинна ДНК ВГВ та кубДНК та реплікативна активність вірусу (співвідношення ДНК ДНК/HBV) вимірювались за допомогою стандартизованої якісної ПЛР (Laras et al., 2006; Volz et al., 2007; Pollicino et al., 2011) та порівняння 99 парних пухлин та непухлинних зразків тканини печінки у пацієнтів з HBV-HCC. Вплив внутрішньоклітинної вірусної ДНК та реплікації вірусу на клінічний результат після хірургічної резекції для лікування.

Матеріали і методи

Пацієнти, гістопатологічна оцінка та спостереження

Це проспективний аналіз 99 хворих на ВГВ-HCC, яким зробили первинну хірургічну резекцію з наміром у Медичному центрі Маунт-Сінай у Нью-Йорку з 2008 по 2013 рік. З цих пацієнтів 90% задокументували противірусну терапію, і більшість з них отримували короткий проміжок часу за час до встановлення діагнозу HCC. Більшість пацієнтів отримували один вид противірусного лікування (82%), 17% отримували два типи противірусного лікування, а 1% отримували три типи противірусного лікування. Найчастіше використовуваними противірусними засобами були ентекавір (39%), тенофовір (34%) та адефовір (23%). Інші противірусні засоби, такі як телбівудин, становлять 4% усіх видів противірусного лікування. Передопераційну сироваткову ДНК ВГВ визначали з медичної картки. У наших інституційних клінічних лабораторіях кількісні показники рівня ДНК ВГВ у сироватці крові використовують за допомогою аналізу HBV AmpliPrep-COBAS TaqMan HBV із зареєстрованим діапазоном 23-2 х 108 МО мл -1 (Faria et al, 2008). Медіана спостереження за вижилими становить 30 місяців.

Зразки резекції печінки оцінював один патолог печінки. Ступінь фіброзу печінки в неопухолевій тканині печінки оцінювали за допомогою модифікованого методу Ісхака (стадії 0-6) наступним чином: ступінь 0 (нормальна печінка); ступінь 1 (розширення декількох портальних шляхів фіброзом); 2 стадія (фіброз усіх портальних шляхів); Етап 3 (волокнисте розширення більшості областей порталу з випадковим переходом порталу до порталу); етап 4 (волокнисте розширення портальних ділянок зі значним мостом); етап 5 (відзначається перетинанням випадкових вузлів); і стадія 6 (продемонстрований цироз з вузликовою тканиною) (Goodman, 2007; Wang et al, 2013b). Пацієнти з множинними пухлинами не були виключені з цього дослідження. Патолог оцінив показник гістологічної активності (HAI, оцінка від 0 до 18), що представляє ступінь незапального ступеня, диференціювання пухлини та інвазію судин.

Детальна методологія діагностики та подальших заходів пацієнта наведена в додаткових матеріалах та методах.

Кількісні внутрішньопечінкові вимірювання HBV ДНК та cccDNA

ДНК HBV і cccDNA ампліфікували з геномної ДНК за допомогою набору для екстракції ДНК QIAamp, як описано раніше (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія, США) (Kuang et al., 2010; Schrader and Iredale, 2011; Wang et al., 2013c). Детальна методологія включена в додаткові матеріали та методи.

Аналіз експресії генів за допомогою РНК-послідовності

Експресію генів оцінювали у підгрупі з 21 пацієнта з використанням технології RNA-seq у неопухолевій печінці (Додаткова таблиця 3). Були включені всі пацієнти з розміром пухлини менше 5 см, або з мінімальним фіброзом печінки (стадії Ishak 0–2, n = 10), або з ймовірним або остаточним цирозом (ступінь Ishak 6, n = 11). Загальна РНК (1-3 мкг на зразок) була подана в Базовий центр Mount Sinai Genomics Core для аналізу контролю якості. Детальна методологія RNA-seq включена в додаткові матеріали та методи.

Рівень експресії генів оцінювали за допомогою RPKM (значення на кілобазу моделі екзону на мільйон відображених показань), які нормувались на довжину гена та загальну кількість відображених показань в одній пробі. Гени, які корелювали з вірусною реплікативною активністю, були ідентифіковані за допомогою кореляційного аналізу Спірмена. При P в 100 разів, від 6607 × 103 копій до 46 × 103 копій, що вказує на ефективність лікування ДНКазою. Кількість копій ДНК HBV в тій самій групі зразків зменшилася з 22 х 103 копій до 3 х 103 копій, що відображає зменшення в сім разів. Кількість копій cccDNA зменшилась з 1 х 103 копій до 0,3 х 103 копій, що відображає трикратне зменшення. Отже, аналіз на основі ПЛР підсилював як вірусний геном, так і інтегровану вірусну ДНК.

Більша кількість копій cccDNA у менших пухлин порівняно з більшими пухлинами

Початкові пухлини (менше середньої, -3 см) мали більшу кількість копій cccDNA на клітину в пухлині порівняно з більшими пухлинами (> 3 см) (середнє значення: 0 0004 копії на клітину, n = 57, порівняно з 0 копіями на клітина, n = 42) (Рисунок 1А). На відміну від цього, кількість копій cccDNA в неопухолевій печінці пацієнтів з малими та великими пухлинами не відрізнялася. У пацієнтів з невеликими пухлинами кількість копій cccDNA не відрізнялася між пухлиною та парною новоутвореною печінкою, тоді як у пацієнтів з більшими пухлинами копія cccDNA пухлини була значно нижчою, ніж парна неопінетична печінка. Подібні висновки спостерігались щодо внутрішньопечінкової ДНК HBV (рис. 1В). Маленька пухлина та великі пухлини не відрізнялися за активністю реплікації вірусу (середнє співвідношення cccDNA/HBV DNA: 0,09 у малих пухлин проти 0,06 у більших пухлин).

Малі HCC (-3 см) мали вищі копії ДНК та HBV ДНК у порівнянні з великими HCC (> 3 см). Графічний графік, що показує копію cccDNA на клітинку ( A ) або копію ДНК HBV на клітину ( B ) у пухлині (суцільні бруски) або неопухолевій печінці (відкриті бруски) у пацієнтів з малим HCC (-3 см) або великим HCC (> 3 cm).

Повнорозмірне зображення

Кількість копій cccDNA пухлини не відрізнялася у порівнянні з диференціацією пухлини, судинною інвазією або продукцією α-фетопротеїну (дані не наведені).

Внутрішньопечінкове вірусне навантаження та вірусна активність на основі сироваткової ДНК HBV та HBeAg

З пацієнтів цього дослідження 90% задокументували противірусну терапію. Незважаючи на противірусне лікування, на момент резекції печінки у 49% пацієнтів була виявлена ​​ДНК ВГВ у сироватці крові та 96% ДНК ВГВ у тканинах печінки. Співвідношення HBV DNA, cccDNA та cccDNA/HBV DNA у пухлинній або непухлинній печінці не відрізнялося між пацієнтами з не виявленою порівняно з пацієнтами з виявленою сироватковою ДНК HBV (Додаткова таблиця 2).

Статус HBeAg безпосередньо перед операцією був доступний для 67 пацієнтів (76% були HBeAg негативними, а 24% були HBeAg позитивними) (Додаткова таблиця 2). Співвідношення cccDNA/HBV ДНК у неопухолевій печінці було значно вищим у HBeAg-негативних пацієнтів, що свідчить про нижчу реплікаційну активність у тканині печінки, тоді як усі інші вірусні властивості не відрізнялись. Крім того, частка HBeAg-негативних пацієнтів була значно вищою у пацієнтів із низькою реплікативною активністю HBV у новоутвореній печінці порівняно з пацієнтами з високою реплікативною активністю HBV (93% проти 62%, P = 0,004) (Додаткова таблиця 3). Тому лише реплікаційна активність HBV у новоутвореній печінці корелювала зі статусом HBeAg у сироватці крові.

Вплив активності реплікації вірусу в пухлині та новоутвореній печінці на виживаність пацієнта та рецидив HCC

Загальний 5-річний рівень виживання 99 пацієнтів становив 72%, а частота рецидивів HCC становила 44% згідно з аналізом Каплана-Мейєра. Більшість рецидивів відбулися протягом 24 місяців після хірургічної резекції. Вплив загальної внутрішньоклітинної ДНК HBV, cccDNA та активності реплікації як на пухлину, так і на неопухолеву тканину печінки на результат вивчали, порівнюючи групи за середніми граничними значеннями (таблиця 2 та малюнки 2A та B). Жодні вірусні характеристики пухлини або новоутвореної печінки не були пов’язані із загальним виживанням.

Стіл в натуральну величину

Вплив активності реплікації вірусу (співвідношення cccDNA/HBV DNA) під час резекції печінки на загальну виживаність та частоту рецидивів після резекції. Загальна виживаність ( A ) і частота рецидивів ( B ) стратифікований за середньою межею співвідношення cccDNA/HBV ДНК у пухлині або неопластичній печінці був побудований за методом Каплана-Мейєра та порівняний за допомогою логарифмічного тесту або тесту Вілкоксона.

Повнорозмірне зображення

Активність реплікації вірусу в неопухолевій печінці була пов'язана з частотою рецидивів HCC (таблиця 2 та малюнки 2A та B). Висока активність реплікації вірусу (нижче співвідношення cccDNA/HBV ДНК) у неопухолевій печінці асоціювалася з вищим рівнем рецидивів (Рисунок 2B). Висока активність реплікації вірусу (нижче співвідношення cccDNA/HBV ДНК) у неопухолевій печінці також була пов'язана з вищими HAI (4, 1 проти 3, 4, P = 0,04) та більш високою стадією фіброзу (4, 7 проти 3, 9, P = 0,01), що узгоджується з нашим попереднім дослідженням у ретроспективній когорті (Додаткова таблиця 3). Коли стадію фіброзу додавали як коваріантну, активність реплікації вірусу в новоутвореній печінці все ще була суттєво пов'язана з рецидивом HCC шляхом регресії пропорційних небезпек Кокса (HR: 2, 1 (1, 0–4, 5), P = 0,04), припускаючи, що активність реплікації вірусу сприяє рецидиву HCC, незалежного від фіброзу.

Експресія генів, пов'язана з активністю реплікації вірусу в неопухолевій печінці

Ми припускаємо, що активність реплікації вірусу та фіброз у новоутвореній печінці можуть впливати на різні біологічні шляхи, що беруть участь у рецидиві HCC. Потім генні сигнатури, пов'язані з реплікативною активністю вірусу або фіброзом печінки в новоутвореній печінці, були проаналізовані у підгрупі з 21 пацієнта за допомогою РНК-послідовності. (Додаткова таблиця 4). З цих пацієнтів 10 мали мінімальний фіброз (стадії Ішака 0-2), тоді як 11 мали фіброз кінцевої стадії (стадії Ішака 6). У всіх 21 пацієнта був HCC -11), що є набором регульованих генів, коли локус ZNF217 був ампліфікований в 20q13. рак (Ginestier et al., 2006). ZNF217 - це цинково-пальцевий білок, який часто посилюється при 20q13 при раку молочної залози (Krig et al., 2010). Білки пальця цинку в цілому збагатились набором генів VRAA (збагачення в 1,6 рази, Р = 0,01).

Існує 1226 генів, які диференційовано експресувались у неопінетичній печінці стадій Ішакського фіброзу 0–2 порівняно з Ішаком 6 стадії (Додаткова таблиця 6). Ці гени були функціонально збагачені для трьох ознак, пов'язаних з раком печінки (Додаткова таблиця 7). Гени, пов'язані з фазою фіброзу Ісхака, дещо перекривались з генами набору генів VRAA, і було виявлено лише 26 загальних генів (Додаткова таблиця 8).

Також було встановлено, чи збагачені ці диференційовано експресовані гени в будь-яких хромосомних положеннях. Гени VRAA були збагачені в регіонах chr19, chr16 та chr3 (P

Пухлина мала нижчу копію cccDNA на клітину порівняно з новоутвореною печінкою. Це може бути пов’язано з розрідженням шляхом поділу клітин пухлини. На мишій моделі активатора плазміногену урокінази/важкого комбінованого імунодефіциту (SCID) проліферація гепатоцитів індукує втрату cccDNA (Lutgehetmann et al, 2010). Дослідження на качиній моделі показали, що противірусна терапія індукує більше зниження cccDNA у тварин з вищою проліферацією гепатоцитів (Addison et al, 2002). Наші дані також свідчать про роль клітинного поділу в регуляції кількості копій cccDNA, оскільки було виявлено, що дрібні пухлини містять більшу кількість копій cccDNA, ніж великі пухлини; а у пацієнтів з невеликими пухлинами кількість копій cccDNA всередині пухлини не відрізнялася від кількості в парній неопухолевій печінці.

Наші спостереження за нижчими рівнями cccDNA в пухлині узгоджуються з недавнім звітом 42 пацієнтів з HBV-HCC (Wang et al., 2013a), але відрізняються від попереднього звіту з 25 пацієнтами з HBV-HCC, які мають більшу кількість копій cccDNA в пухлині як пацієнти без новоутвореної печінки (Wong et al., 2006). Причини відмінностей від попереднього дослідження не ясні, хоча наше дослідження кількісно визначило кількість копій ДНК HBV та cccDNA на клітину шляхом вимірювання та нормалізації кількості копії альбуміну у всіх зразках та не розрахувало кількість клітин на основі оцінки 6,667 pg геномної ДНК на клітину (Wong and col., 2006).

Наші попередні ретроспективні дослідження показали, що активність реплікації вірусу в новоутвореній печінці пов'язана з поганою загальною виживаністю після хірургічної резекції, але не з виживання без рецидивів. Це поточне дослідження відрізняється від цього дослідження кількома способами. Це поточне дослідження включало пацієнтів з хірургічною резекцією з 2008 по 2013 рік, тоді як попереднє дослідження включало пацієнтів з 1991 по 2008 рік. Також слід зазначити деякі відмінності, такі як менший розмір пухлини в поточному дослідженні (4, 3 ± 3, 6 проти 7,3 ± 5,0 см). У цьому дослідженні вірусну ДНК вимірювали за допомогою свіжих зразків хірургічної резекції, тоді як у попередньому дослідженні вірусну ДНК вимірювали за допомогою ДНК, виділеної з архівованих блоків парафіну. Незважаючи на всі ці відмінності, це поточне дослідження підтверджує наші попередні спостереження про те, що активність реплікації вірусу корелює зі стадією HAI та Ishak, і що висока активність реплікації вірусу пов'язана з поганим результатом. Оскільки ці пацієнти продовжуватимуть спостерігатись, вплив реплікації вірусу на виживання без рецидивів та загальну виживаність буде додатково оцінено.

Підводячи підсумок, це дослідження забезпечує пряме порівняння внутрішньоклітинної ДНК HBV, cccDNA та активності реплікації вірусу в пухлинній та непластичній печінці. Дані показали, що висока реплікаційна активність в неопухолевій печінці пов’язана з більш високим рівнем рецидивів HCC через механізми, які відрізняються від стадії фіброзу Ісака та не залежать від них.

Історія змін

Додаткова інформація

Документи Word

Додаткові матеріали та методи

Файли PDF

Додаткові таблиці 1-8

Ця робота публікується на основі стандартної ліцензії на публікацію контракту. Через 12 місяців робота стає вільно доступною, а умови ліцензії переходять на непублічну ліцензію Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 4.0.