основи

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • Ретигабінова модуляція каналів KCNQ через Trp S5
  • Неприродний амінокислотний мутагенез каналів KCNQ3
  • Втрата ефектів ретигабіну після усунення зв’язку Trp265 H
  • Точне налаштування сили взаємодії Trp265-ретигабін
  • Відносний внесок передбачуваних залишків, що зв’язують ліки.
  • Ідентифікація ймовірного донора, що зв’язує H, у ретигабіні
  • Обговорення
  • Методи
  • Молекулярна біологія і у природніх умовах придушення нісенітниці
  • Записи двоелектродного затиску напруги
  • Молекулярне моделювання зв’язування ретигабіну
  • Аналіз даних
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

Предмети

  • Іонні канали
  • Мембранні білки
  • Молекулярна біофізика

Резюме

Вступ

Епілепсія - це поширене, неоднорідне та часто виснажливе захворювання, яке вражає приблизно 1% населення світу. Сучасне клінічне лікування пацієнтів, які страждають на епілепсію, здійснюється переважно медикаментозно, хоча загальновизнано, що that 30% вперше діагностованих хворих на епілепсію будуть стійкими до звичайних протисудомних препаратів 1, 2. Крім того, зазначений опір корелює з типом атаки; наприклад, повідомляється, що 60% пацієнтів з вогнищевою епілепсією розвиватимуть і підтримуватимуть резистентність до наркотиків 3. Ці недоліки спонукали до пошуку нових протиепілептичних препаратів, нетрадиційних методів лікування епілепсії (таких як кетогенна дієта) та постійного виявлення та підтвердження нових фармакологічних цілей 4, 5, 6, 7 .

Ми використовували неприродний амінокислотний мутагенез для тонкої перестановки атомів та електронів з бічного ланцюга Trp у місці зв'язування ретигабіну. Отримані нами результати демонструють, що репозиціонування індольного атома азоту KCNQ3 Trp265 повністю усуває ефекти ретигабіну, припускаючи, що взаємодія ретигабіну вимагає утворення Н-зв'язку з Trp265. Важливість цієї взаємодії Н-зв'язків додатково ілюструється введенням фторованих аналогів Trp (з вищою схильністю до Н-зв'язків) до KCNQ3 Trp265, що призводить до збільшення ефективності препарату. За допомогою кількох аналогів ретигабіну ми виявили електростатичний відбиток пальця навколо акцептора H-зв’язку, який корелює з ефективністю препарату. Ці експериментальні обмеження визначають конкретні атоми та хімічні сили, що беруть участь у взаємодії ретигабіну, та виділяють підходи, які можуть бути використані для раціонального вдосконалення існуючих препаратів.

Результати

Ретигабінова модуляція каналів KCNQ через Trp S5

( до, b ) Співвідношення провідність-напруга для ( до ) KCNQ2 (n = 3) і KCNQ2 [Trp236Phe] (n = 6), і ( b ) KCNQ3 * (n = 5) та KCNQ3 * [Trp265Phe] (n = 3) гомомерні канали разом із зазначеними мутантами (концентрація ретигабіну 100 мкМ). ( c ) Відношення провідності та напруги для гетеромерних комбінацій KCNQ2 та KCNQ3 (співвідношення 1: 1 введеної мРНК, з мутацією Trp → Phe або без неї, як зазначено, n = 5 для кожної комбінації), що використовується для формування каналів зі зменшеною кількістю зв’язування ретигабіну сайтів. ( d ) Короткий зміст змін V 1/2 в 100 мкМ насичення ретигабіном для мутацій KCNQ2 Trp236 та KCNQ3 Trp265, як зазначено (* P 19, 20 .

Ми перевірили, чи відіграє роль положення KCNQ3 Trp 265 у регулюванні реакцій каналів на PIP 2. Використовуючи чутливу до напруги фосфатазу ciona intestinalis, чутливу до напруги фосфатазу (CiVSP) для гідролізу PIP 2 при деполяризованих напругах, ми імпульсували ооцити через діапазон попередніх імпульсних напруг з подальшим тестовим імпульсом -20 мВ для оцінки активності каналу після виснаження PIP 2 27 . Ми спостерігали подібне зменшення каналу з кроками напруги деполяризації в каналах KCNQ3 * і KCNQ3 * [Trp265Phe], вказуючи, що Trp265 не суттєво впливає на вплив аніонних фосфоліпідів на функцію каналу (рис. 1д, f). Загалом, ці висновки ілюструють, що залишок KCNQ3 Trp265 є важливим для ефектів ретигабіну, але не відіграє суттєвої ролі в регуляції активації каналу напругою або PIP 2. .

Неприродний амінокислотний мутагенез каналів KCNQ3

Щоб дослідити основний механізм взаємодії ретигабіну з цим важливим бічним ланцюгом Trp, ми застосували неприродний амінокислотний мутагенез, щоб ввести дещо змінені варіанти Trp (рис. 2а). За допомогою цього методу стоп-кодон (TAG) поміщається в ген іонного каналу на цікавому місці, і ця мРНК вводиться спільно в ооцити Xenopus laevis разом із синтетичною амінованою ацильованою тРНК (несучи неамінокислоту ) .природний), який ортогональний синтетичним шляхам тРНК 28 Xenopus. Коли рибосомальний механізм трансляції зустрічає введений TAG-стоп-кодон, додаткова синтетична тРНК (з антикодоном CUA) дозволяє зчитувати додану амінокислоту та включати її в іонні канали повної довжини (рис. 2а) 29 .

Втрата ефектів ретигабіну після усунення зв’язку Trp265 H

Відносний внесок передбачуваних залишків, що зв’язують ліки.

( до ) Зв'язок провідності та напруги збирали для вказаних мутантних каналів KCNQ3 * (n = 4-6 на мутанта) в 0, 100 або 300 мкМ ретигабіні. ( b ) ΔV 1/2 максимум у 300 мкМ ретигабіну, виміряний у кожному мутантному каналі. Бари помилок у до, b представляють sem ( c ) Ретигабін був пов'язаний з молекулярною моделлю пороутворюючого домену KCNQ3 (див. Посилання 19). Показано дві орієнтації групи карбаматів поблизу Leu314 (`` оригінальна '' модель) або Trp265 (`` фліп '' модель). Дві схеми зв'язування перекриваються в "накладці", показуючи подібний простір, який займають обидві лікарські орієнтації.

Повнорозмірне зображення

Ідентифікація ймовірного донора, що зв’язує H, у ретигабіні

Подальше ми досліджували механізм зв’язування Н з Trp265 шляхом пошуку потенційних акцепторів Н-зв’язків на молекулі ретигабіну, завданням якого сприяло наявність численних аналогів ретигабіну. Спочатку ми розглянемо аналог ML-213, оскільки він має спрощену хімічну структуру порівняно з ретигабіном та зменшену кількість можливих акцепторів Н-зв’язків (рис. 6а, б). Ми виявили, що ML-213 є більш потужним активатором KCNQ3 * порівняно з ретигабіном (EC 50 = 3,6 ± 0,2 мкМ, n = 5, проти 11,6 ± 0,4 мкМ, n = 5, відповідно, рис. 6c, ± вказано) . Ми також включили розраховані електростатичні поверхневі потенціали для ретигабіну та ML-213, ілюструючи, що негативний поверхневий потенціал навколо карбонільного кисню є більш вираженим для ML-213 (червоний удар, рис. 6a, b).

( до, b ) Хімічні структури та електростатичні поверхневі потенціали для ретигабіну та ML-213. Зверніть увагу на потенційне негативне збільшення поверхні поблизу атома карбонільного кисню в ML-213. Шкала для представлення електростатичного поверхневого потенціалу червона: −80 ккал, жовта: 0 ккал, синя: +80 ккал. ( c ) Криві концентрація-відповідь для впливу ретигабіну та ML-213 (n = 5) на канали KCNQ3 * (n = 5). Смужки помилок представляють сім

Повнорозмірне зображення

( до ) Хімічні структури та електростатичні поверхневі потенціали для серії аналогів ретигабіну. Усі структури та карти поверхневого потенціалу вирівняні на основі розташування збереженого амідно-ефірного зв'язку; Зверніть увагу на градієнт інтенсивності негативного поверхневого потенціалу навколо атома карбонільного кисню (шкала така ж, як на рис. 6). ( b ) Резюме, що ілюструє EC50 кожного лікарського засобу в каналах KCNQ3 * [Trp265TAG], врятованих Trp, F 3 -Trp та Ind-Rescued (n = 4-9 на точку даних), а також максимальна ефективність (ΔV 1/2) кожного препарату у врятованих каналах F 3 -Trp та Trp (вплив на врятовані канали Ind мінімальний і тому опущений). Смужки помилок представляють сім

Повнорозмірне зображення

Обговорення

В даний час ретигабін - єдиний лікарський засіб, широко схвалений для клінічного застосування, який діє шляхом активації калієвих каналів, керованих напругою 35. Детальне дослідження цього прототипу лікарського засобу може поглибити наше розуміння того, як ліки можуть діяти як активатори іонних каналів і прискорити розвиток активаторів калієвих каналів з вищою потужністю або специфічністю. Такі препарати можуть мати невикористаний терапевтичний потенціал для лікування різноманітних розладів `` підвищеної збудливості '' на додаток до епілепсії, таких як больові синдроми, гіпертонія та серцеві аритмії 9, 36. Крім того, нещодавні звіти висвітлювали ефективність ретигабіну при лікуванні шуму у вухах, хвороби Паркінсона та хвороби Хантінгтона 37, 38, 39 .

На початку нашого дослідження, химерні дослідження з нечутливим до ретигабіну каналом KCNQ1 виявили важливість залишку Trp (KCNQ3 Trp265) у пороутворюючій області поблизу передбачуваних воріт цитоплазматичного каналу. Взаємодії ретигабіну з цим сайтом були раціоналізовані як загальні гідрофобні взаємодії з цим збереженим залишком Trp (також присутній у KCNQ2, 4 та 5) 19, 20 .

Для висвітлення загальних характеристик амідної групи, оточеної різними кільцевими структурами, представлені декілька структур сошників для каналів KCNQ. Наші висновки підкреслюють важливість амідного карбонілу для взаємодії з KCNQ3 Trp 265 та ймовірні еквівалентні положення в KCNQ2, 4 та 5. Представлені препарати ( до ) ретигабін, ( b ) ztz-240 (описаний у посиланні 24), ( c ) акриламід (и) -1, ( d ) BMS-204352 та ( і ) неназваний експериментальний препарат, описаний у посиланні 43)

Повнорозмірне зображення

Однією останньою заслуговує на увагу деталлю є те, що, хоча наші висновки окреслюють атомну основу взаємодії ретигабіну з KCNQ3 Trp265 (та аналогічними залишками в KCNQ2, 4, 5), є суттєві докази щодо додаткових місць взаємодії, які дозволяють потенціювати деякі субодиниці KCNQ. Наприклад, повідомляється, що випробовувані сполуки ICA (та інші споріднені сполуки, такі як ztz-240), разом із сімейством похідних диклофенаку, впливають на канали KCNQ2 незалежно від збереженого залишку Tr5 та демонструють значно сильніші ефекти на KCNQ2. відношення до KCNQ3 (посилання 22, 24, 25, 30). Крім того, не пов’язані сошники KCNQ, такі як піритіон цинку, схоже, не залежать від взаємодії водневих зв'язків, яку ми виявили в цьому дослідженні 48. Отже, безперервне дослідження зв’язку ліків з різними підтипами каналів KCNQ може допомогти виявити додаткові ділянки для посилення KCNQ.

На закінчення ми використали неприродний амінокислотний мутагенез та доступні аналоги ретигабіну, щоб локалізувати ефекти зв’язування ретигабіну до взаємодії однієї Н-зв’язку з KCNQ3 Trp265. Ці висновки підкреслюють незвичайний режим взаємодії лікарських засобів з бічним ланцюгом Trp і демонструють важливість ретельного дослідження механізму взаємодії препаратів для керівництва раціональною модифікацією терапевтичних сполук.

Методи

Молекулярна біологія та придушення нісенітниць in vivo

Похідні фторованого Trp (5-F 1 -Trp; 7-F 1 -Trp; 5, 7-F 2 -Trp (F 2 -Trp) та 5, 6, 7-F 3 -Trp (F 3 -Trp) придбаний у Asis Chem (Уотертаун, Массачусетс) та Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі). Варіант "Ind" Trp був синтезований власноруч, як описано раніше 31, 50. Включення неприродних амінокислот у білки іонних каналів як широко описано в попередніх публікаціях 29, 34, 51. Коротко, неприродні амінокислоти (аа) захищали нітровератрилоксикарбонілом і активувались як ціанометиловий ефір, який потім з'єднували з динуклеотидом pdCpA (GE Healthcare/Dharmacon, Lafayette, CO) Згодом цей аміноацилдінуклеотид лігували до модифікованої (G73) тетрафінової термофільної тРНК. Аміноацильована тРНК-аа була знята з ультрафіолетового опромінення безпосередньо перед ін’єкцією ооцитів. У типовому експерименті 80 нг тРНК-аа та 40 нг KCNQ3 кРНК вводили в обсязі 50 нл. У контрольних експериментах кРНК окремо або кРНК разом th вводили тРНК, сполучену з pdCpA, але без доданої амінокислоти (ці паралельні контрольні експерименти проводились кожен експериментальний день, а результати описуються в тексті).

Записи двоелектродного затиску напруги

Потоки калію, затиснуті напругою, реєстрували в стандартному розчині Рінгера (в мМ): 116 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, 5 HEPES (pH 7,4) за допомогою затискача напруги OC-725C (Warner, Hamden, CT) . Скляні мікроелектроди засипали 3 М KCl і мали опори 0,1–1 МОм. Дані фільтрували на частоті 5 кГц та оцифровували на частоті 10 кГц за допомогою Digidata 1440A (молекулярні пристрої), керовані програмним забезпеченням pClamp 10 (молекулярні пристрої). Наркотики купували у Toronto Research Chemicals (ретигабін) або Tocris (ML-213, флупіртин, ICA-069673, ICA-110381), зберігали у вигляді 100 мМ запасів в диметилсульфоксиді і розводили до робочих концентрацій кожен експериментальний день.

Молекулярне моделювання зв’язування ретигабіну

Аналіз даних

Залежність напруги активації каналу оснащена стандартним однокомпонентним рівнянням Больцмана виду G/G max = 1/(1 + e− (V_V1/2)/k, де V 1/2 - напруга, де канали демонструють половину максимуму активація, а k - коефіцієнт нахилу, що відображає діапазон напруги, в якому спостерігається е-кратна зміна Po. Для формування кривих концентрації - реакції на ретигабін та похідні, Δ V 1/2 (зсув напруги напівактивації) був нормалізований до максимального Δ V 1/2, що спостерігався, і відповідав наступному рівнянню: нормований Δ V 1/2 = 1/(1 + EC 50/[препарат]). Статистичні тести та значення описані в легендах на рисунках у всьому текст.

Додаткова інформація

Файли PDF

Додаткова інформація

Додаткова таблиця 1

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов та правил спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, позначте це як неприйнятне.