БІБЛІОГРАФІЧНИЙ ОГЛЯД БІОРОЗРОБЛЮЮЧИХ МІКРООРГАНІЗМІВ ПОЛІЕТИЛЕНУ МІСКОЇ ЩІЛЬНОСТІ ТА ЇХ ВПЛИВ НА МАТЕРІАЛ Нельсон Рикардо Акунья Молина 2017 рік
БІБЛІОГРАФІЧНИЙ ОГЛЯД ПОЛІЕТІЛЕНОВОЇ БІОРОЗРАБОТКИ МІКРООРГАНІЗМІВ І ЇХ ЕФЕКТІВ НА МАТЕРІАЛ Нельсон Рікардо Акунья Моліна ДИСЦІПЛЕНТНА РОБОТА ДЛЯ ВИБІРУ ДІЯЛЬНОСТІ ХІМІЇ Директори: Хорхе Алонсо Лейнасі Рожас. Співрежисер: доктор філософії Маріо Санчес Родрігес. UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS НАУКОВО-НАВЧАЛЬНИЙ ФАКУЛЬТЕТ ПРОЕКТ БАКАЛАВРА В ХІМІЇ БОГОТА 2017 I
Приймальна записка Президент журі Журі журі Богота, округ Колумбія (01, березень 2017 р.) II
Присвята моїй матері та всім викладачам, які заохочували та посилювали мою цікавість та любов до науки, а також тим, хто керував та допомагав мені здобувати свої наукові знання та вміння. III
ДЯКУЮ Дякую своїй матері за її постійну підтримку, своїм вчителям за всі їхні вчення, особливо моїм режисерам та співрежисеру Хорхе, Джозуе та Маріо за їх зусилля та підтримку, а також всім моїм друзям, які певним чином внесли свої поради та пропозиції. в реалізації цієї роботи, особливо Девід Леонардо Кастилія та Нестор Олександр Замбрано, які люб'язно внесли свій внесок у свої відгуки та пропозиції. IV
ЗМІСТ Перелік сторінок таблиць X Перелік рисунків XI Перелік рисунків XIII Перелік додатків XIV Скорочення XV Глосарій XVI 1. РЕЗЮМЕ 1 2. ВСТУП 2 3 ЗАВДАННЯ 2 3.1 Загальні цілі 2 3.2 Конкретні цілі 3 4. СПОСІБ ТА ОБґрунтування 3 4.1. Визначення задачі 3 4.2. Історичний огляд 4 4.3 Альтернативи контролю ПВД 5 4.3.1 Поховання на звалищах ПНД 5 4.3.2 Спалення ПЕВП 5 4.3.3 Піроліз ПНД 6 4.4. Політика щодо переробки 6 4.4.1 Екологічна проблема, спричинена ПВД 7 5 ТЕОРЕТИЧНА КАДР 7 5.1 Полімери 8 5.1.1 Пластмаси 8 5.1.2 Поліолефіни 8 5.1.2.1.1 Поліетилен (ПЕ) 8 5.1.2.1.2 Класифікація ПЕ 8 5.1 .2.1.2.1 Поліетилен низької щільності (LDPE) 9 5.1.2.1.2.2 Лінійний поліетилен низької щільності або (LLDPE) 9 5.1.2.1.2.3 Поліетилен високої щільності (HDPE) 9 5.1.2.1.2.4 Причини хімічної інертності поліетилену 10 5.2 Біополімери, замінники ПВД 10 5.2.1 Природні біополімери 10 5.2.2 Синтетичні біополімери 10 5.2.3 Біопластика 11 5.2.3.1 Біопластика, що повністю розкладається 11 5.2.3.2 Біофрагментарна біопластика 11 5.3 Біоремедіація 11 5.3.1 Біодеградація низьких щільність поліетилену 11 (ПВД) 5.3.1.1 Біопогіршення 12 5.3.1.2 Асиміляція 12 В
5.4.2.6.1 Життєздатність мікробної біоплівки 62 5.4.2.6.2 Попередні тести на характеристику 62 5.4.2.6.3 Конкретні ідентифікаційні тести 62 5.4.2.7 Продукти біологічного розкладання 62 5.5 Запропонована методологія 63 5.5.1 Тест на життєздатність мікроорганізмів 64 життєздатних на пластині розведення 5.5.1.1 Відбір проб та відбір мікроорганізмів, що руйнують ПЕВП, у рідкому середовищі SM 5.5.1.2 Попередня ідентифікація 65 5.5.1.3 Попередні тести на ідентифікацію грибків 66 5.5.1.4 Тест на біологічне розкладання in vitro 67 5.5.2 Тест на втрату маси 67 5.5.3 Специфічна ідентифікація 67 5.5.3.1 Техніка 69 поліморфізму рестрикційних фрагментів (RFLP) 5.5.4 Інструментальні випробування 69 5.5.4.1 Застосування FTIR для дослідження біодеградації ПНД 69 5.5.4.1.1 Варіанти методики 69 5.5.4.1.1.1 FT-IR Спектроскопія ATR 69 5.5.4.1.1.2 FT-IR дифузне відбиття (DRIFT) 70 5.5.4.1.2 Індекси кількісної оцінки окислення 70 5.5 .4.1 .2.1 Карбонільний індекс (ДІ) 70 5.5.4.1.2.2 Вініловий індекс (IV) 70 5.5.4.1.2.3 Відсоток (%) кристалічності ПВД 70 5.5.4.2 Газова хроматографія в поєднанні з масовою спектроскопією 71 GCMS 5.5.4.2 .1 Кількісне визначення виробництва CO 2 71 6 АНАЛІЗ 72 7. ВИСНОВКИ 77 8. РЕКОМЕНДАЦІЇ 78 9. БІБЛІОГРАФІЯ 79 65 IX
СПИСОК ФІГУРІВ Сторінка Рисунок 1 a Лінійний поліетилен низької щільності (LLDPE) 9 Рисунок 1 b Поліетилен низької щільності (LDPE) 9 Рисунок 1 c Поліетилен високої щільності HDPE 9 Рисунок 2 Фактори, що впливають на біологічне розкладання LDPE 13 Рисунок 3 Шляхи гіпотетичного перетворення поліетилену до його загальна мінералізація 14 Рисунок 4. Біодеградація ПЕ шляхом β-окислення 14 Малюнок 5 Ініціатори окислення ПЕ 15 Рисунок 6 Механізм гемолітичного руйнування або фотолізу 16 Рисунок 7 Ініціювання з металевого агента 16 Рисунок 8 Поширення фотоокислення 17 Рисунок 9 а Механізми окислення за реакціями Норріша типу 1 та 2 17 Рисунок 9 b Окислення для утворення жирних кислот або 17 складних ефірів Рисунок 10 Методи та методи, доступні для вивчення деградації ПВД 37 Рисунок 11 Запропонована основна методологічна схема 64 Рисунок 12 Попередні методи метаболічної ідентифікації 66 Рисунок 13 Методологія, яку слід провести для конкретної ідентифікації a 68 Рисунок 14 Процедура виділення біологічно розкладаються мікроорганізмів LDPE Рисунок 15 Процедура культивування, виділення та ідентифікації мікроорганізмів, що розкладають LDPE 100 101 XI
СПИСОК ГРАФІК Сторінка Графік 1. Варіації у світовому виробництві пластмас з 1950 по 2010 Графік 1. Б Варіації у світовому виробництві пластмас з 1950 по 2013 Графік 2. Частка зареєстрованих жанрів, пов’язаних з біодеградацією (ПНД) Графік 3. Методи найбільше використовується для вивчення біодеградації ПЕНШ 4 4 75 76 XIII
СПИСОК ДОДАТКІВ Сторінка ДОДАТОК А1. ДОДАТОК А2. ДОДАТОК B. Виділення та підрахунок біодеградуючих мікроорганізмів LDPE Культура біодеградуючих мікроорганізмів LDPE Очищення біодеградуючих мікроорганізмів LDPE 100 101 102 ДОДАТОК Тест біодеградації LDPE 103 ДОДАТОК D Екстракція ДНК з грибів 104 ДОДАТОК E. Екстракція ДНК з бактерій 105 ДОДАТОК F. Дискримінація між мікробними групами з використанням RFLP 106 ДОДАТОК G1. Тести на ідентифікацію бактерій 107 ДОДАТОК G2. Тести на ідентифікацію бактерій 108 ДОДАТОК G3. Тести на ідентифікацію бактерій 109 ДОДАТОК G4. Тести на ідентифікацію бактерій 110 ДОДАТОК H Список речовин для середовищ та тести 111 ДОДАТОК I Запропонована процедура посіву 114 ДОДАТОК J1 Таблиця попередніх характеристик бактерій 115 ДОДАТОК J2 Попередні характеристики бактерій 116 ДОДАТОК J3 Попередні характеристики бактерій 117 ДОДАТОК K1 Процедура аналізу поліетилену з використанням ДОДАТОК FTIR K2 Процедура аналізу поліетилену з використанням FTIR ДОДАТОК L1 Кількісна оцінка вироблення СО 2 та ідентифікація метаболітів ДОДАТОК L2 Кількісна оцінка вироблення СО 2 та ідентифікація метаболітів 118 119 120 121 XIV
5.1.2.1.2.1 Поліетилен низької щільності ПЕВТ Його структура сильно розгалужена (приблизно у 2% атомів вуглецю) [51]. Його молекулярна маса становить 100 000-300 000 [г/гмоль], а щільність 0,90-0,91 [г/см 3], що є найнижчою щільністю, і це відбивається на його реологічних якостях, він використовується у виробництві одноразових пакетів. 5.1.2.1.2.2 Лінійний поліетилен низької щільності або (LLDPE), який є варіантом з невеликим розгалуженням, можна класифікувати як проміжну кристалічність, при цьому значення 0,915 г/см 3 є відносно компактним. 5.1.2.1.2.3 Поліетилен високої щільності (ПНД). Його структура має найвищий ступінь лінійності, його молекулярна маса становить 200 000-400 000, [г/гмоль], а щільність становить 0,94-0,97 0,91 -0,94 [гр/см 3], завдяки цьому це дуже жорсткий і міцний матеріал, який використовується у виробництві пластикових банок. а) б) 1000 в) 4000 1000 Рисунок 1 структури з поліетилену, а) лінійний поліетилен низької щільності (ПНДВ); b) поліетилен низької щільності (LDPE); в) поліетилен високої щільності HDPE. 9
ступінь окиснення матеріалу та тип доданої добавки, яка може бути крохмалем або прооксидантами. В результаті звітованих робіт було здійснено гіпотетичний механізм біодеградації, який показаний нижче. Рисунок 3 Гіпотетичні шляхи перетворення поліетилену до його повної мінералізації на основі статей [63, 45, 68]. Рисунок 4 Біодеградація ПЕ за допомогою джерела β-окислення [65] 14
Автор усвідомлює, наскільки трудомістким і дорогим може бути проведення такої кількості тестів, як попередня ідентифікація, так і конкретна ідентифікація можуть тривати місяцями чи, можливо, роками. Основна методологічна структура буде такою: Рисунок 11 Запропонована основна методологічна схема 5.5.1 Тест на життєздатність життєздатних мікроорганізмів шляхом розведення пластин Пропонується тест на життєздатність або розведення пластин та кількість одиниць, що утворюють колонії, оскільки це також легко та швидко відокремлення та індивідуалізація видів мікроорганізмів вуглеводнів (принаймні тих, які можуть вижити in vitro). (Див. ДОДАТОК L2) Розрахунки 1) Підрахуйте лише ті ящики (розведення), які містять від 30 до 300 колоній. 2) За допомогою наступного рівняння обчисліть КУО/г с.с. КУО/г пе. = (NC 1/FD 1/V)/(P FH). Де: КУО/г пе. = колонієутворюючі одиниці/г PE. NC = кількість колоній в коробці. FD = коефіцієнт розбавлення, що відповідає розведенню, з якого відібрали зразок, з яким прищеплюють коробку (10-2-10-10). V = об'єм, внесений у коробку = 0,1 мл. Р = маса вологого зразка = 1 г. FH = коефіцієнт корекції вологості (1 (% вологості/100)). 64
5.5.1.1 Отримання зразка та відбір мікроорганізмів, що руйнують ПЕВП, у рідкому середовищі СМ Запропоновано зробити селективне рідке середовище СМ, оскільки воно ідеально підходить для розвитку біологічно розкладаються мікроорганізмів ПВД, і воно також було протестовано в результаті численних досліджень біодеградації породжує надійність. Збір зразка Попередня обробка зразка Додавання до рідкого культурального середовища Інкубація (див. ДОДАТОК А 2). 5.5.1.2 Попередня ідентифікація Для ідентифікації родів бактерій можна провести такі біохімічні та мікробіологічні тести, такі як каталаза, на бактерії (див. ДОДАТОК G1). до. Тіогліколятний відвар ОФ; b. Тест на оксидазу c. Тест на каталазу d. Малонатний тест e. Цитратний тест j. Тест на бродіння, 2,3-бутандіолу та змішаної кислоти. Ф. Тест на гіппурат g. Тест Кліглера h. Ці заліза три цукру i. Тест MR/VP k. Лізин залізо агар л. Агар фенілаланіндемінанази m. Моллер н. Декарбоксилювання амінокислот 65
Рисунок 12 Попередні методи метаболічної ідентифікації 5.5.1.3 Попередні тести для ідентифікації грибів Для грибів будуть проведені такі тести: Для виділення та підрахунку грибів, що погіршують РЕ, застосовували ту саму техніку та середовище, що і для бактерій, з різниця в тому, що троянду бенгальську та стрептоміцин додають до середовища та рН доводять до 4,9 [187]. Для їх вирощування можна використовувати агар сабуро, КПК, бавовна лактофенолового синього (LPCB), а для їх ідентифікації - мікроскопічне та макроскопічне спостереження. 66
Аликвоти ампліфікованого гена, отримані в результаті ПЛР з цими універсальними праймерами, можна недорого секвенувати в комерційних лабораторіях або в багатьох випадках в університетських лабораторіях. Як тільки буде відома послідовність гена rrna, їх можна використовувати для ідентифікації вихідних мікроорганізмів на рівні роду та виду [271]. Послідовності величезної кількості видів бактерій комп'ютеризовані в базах даних [271]. Це дозволяє порівняти невідому послідовність ррна з відомою послідовністю бактерій [271]. Доступно багато програм аналізу послідовностей, які допоможуть ідентифікувати послідовності. Однією з таких баз даних є BLAST (Basic local alignment search tool), що означає місцевий інструмент пошуку базових вирівнювань, який надається (NCBI) Національним центром біотехнологічної інформації, доступним в Інтернеті [271]. Універсальні праймери 16S rrna взяті з [271]. 8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R TACGGY * TACCTTGTTACGACTT * Y може бути C або T у виродженому базовому положенні. Рисунок 13 Методологія, яка буде використана для конкретної ідентифікації 68
вони обмежують їх використання [67], що є необхідним покращенням навіть у цих питаннях. Коли всі ці бар'єри подолані, напевно незабаром, проблема може бути остаточно вирішена або можуть виникнути інші нові проблеми, лише час покаже, але зловживання, безвідповідальність та несвідомість наших дій як суспільства все ще будуть і повинні бути проблемами для викорінити з свідомості суспільства. Правда полягає в тому, що, хоча про них повідомляють найбільше, це не означає, що вони найкраще виконують цю роботу, просто що вони є найбільш повсюдними на сьогоднішній день. Без сумніву, Aspergillus sp. Вони є найбільш повсюдними мікроорганізмами, що руйнують поліетилен, знайденими на сьогоднішній день, і вони дуже далекі від інших родів із 81 видом, що свідчить про те, що гриби дуже універсальні та невибагливі до навколишнього середовища, їжі та умов, крім того, що вони дуже популярні серед дослідників. Графік 2 Кількість посилань, отриманих за родом грибів та бактерій, які пов'язані з біодеградацією (ПЕВП). 75
ДОДАТОК A1 Виділення та кількість мікроорганізмів, що руйнують ПЕВП Рисунок 14 Процедура виділення біодеградуючих мікроорганізмів LDPE, адаптована за [187, 94] Для виділення та підрахунку грибів, що руйнують ПЕ, застосовували ту ж техніку та середовище, що і для бактерій. що до середовища додають троянду бенгальську та стрептоміцин, і рН доводять до 4,9. 100
ДОДАТОК A2 Виділення та ідентифікація мікроорганізмів, що руйнуються LDPE Рисунок 15 Процедура культивування, виділення та ідентифікація мікроорганізмів, що руйнуються LDPE. 101
ДОДАТОК B Очищення та виділення мікроорганізмів, що руйнуються LDPE Рисунок 16 Процедура виділення мікроорганізмів, що руйнують LDPE, та їх подальше розмноження для екстракції ДНК. Для вилучення грибкової ДНК її не слід сіяти на агар, оскільки зішкріб залишає сліди середовища, які заважають екстракції ДНК.Запропонований метод, зареєстрований Рохасом Тривіньо [276] 102
ДОДАТОК C Тест біодеградації LDPE Рисунок 17 Тест біодеградації in vitro, адаптований за [237, 126] 103
ДОДАТОК D Вилучення ДНК з грибів Рисунок 18 Запропонований спосіб - метод, зареєстрований Махаку, модифікований [203]. 104
ДОДАТОК E Екстракція ДНК з бактерій Рисунок 19 Метод вилучення ДНК - це метод, який зареєстровано Міжнародним центром тропічного землеробства (CIAT) за допомогою буфера екстракції (CTAB). 14 мл EDTA ph 8,0 0,5 М 2,0 мл Трис-HCl ph8,0 1М 5 мл SDS - 0,5 г Стерильна дистильована вода До 50 мл Концентрація реагенту Кількість NaCl 1,4 М 8,18 мл EDTA ph 8,0 20 мМ 4, 0 мл Трис-HCl ph8,0 100 мМ 10 мл CTAB 2% 2 г PVP 40 1% 1 г Рисунок 20 Кількісне визначення мікробної ДНК 105
ДОДАТОК F Дискримінація ПЛР між мікробними групами з використанням поліморфізму довжини фрагмента обмеження (RFLP) Рисунок 21 Методологічна пропозиція щодо використання техніки RFLP, взята та адаптована з [277]. 106
ДОДАТОК G1 Тести на бактеріальну ідентифікацію Рисунок 22 - Ідентифікація бактерій за допомогою агарового тесту LIA, Кліглера, тіогліколяту та триптофану. 107
ДОДАТОК G2. Тести на ідентифікацію бактерій Малюнок 23 Тести на ідентифікацію мікробів, крохмальний порошок, TCI, каталаза-оксидаза 108
ДОДАТОК G3 Тести на ідентифікацію бактерій Рисунок 24 Тести на декарбоксилювання лізину або орнітину, фенілаланіндеаміназа 109
ДОДАТОК G4 Рисунок 25 Тести на МРТ VP, OF та ферментацію глюкози 110