Предмети

Резюме

Вступ

Матеріали і методи

Пацієнти та сироватки

Екстракції білка

Загальний білок 50 мг-с витягували з чисто подрібнених насіння B. distachyon лінії Bd21 відповідно до протоколу Dupont et al. 13. Коротко, екстракційний буфер SDS-Tris (pH 6,8), що містить 2% SDS, 10% гліцерину, 50 мМ DTT і 40 мМ Tris-HCl, pH 6,8, використовували для вилучення загального білка при кімнатній температурі протягом однієї години із регулярним вмістом доза. вихор. Екстракт центрифугували при 16000 g протягом 15 хвилин. Супернатант осаджували чотирма обсягами крижаного ацетону. У процесі екстракції використовували п’ять біологічних копій.

Двовимірний гель-електрофорез та імуноблотинг

Після осадження гранулу розчиняли буфером IEF (8M сечовини, 2% CHAPS, 100mM DTT, 0,2% CA і 0,1% бромофенолового синього). Ізоелектричне фокусування проводили в Immobiline DryStrips pH 7-10 7 см (GE Healthcare), в умовах регідратації протягом ночі з 200 мкг білка в 150 мкл буфера IEF. Для розділення білків відповідно до їх молекулярної маси використовували 12% поліакриламідні гелі. 2D GE проводили у трьох технічних копіях. Оскільки всі 2D-білкові структури з різних біологічних та технічних копій були однаковими, остаточний вбудований нано-LC-MS/MS проводили з трьох технічних копій 2D GE, і плями об’єднували.

Після того, як білки GE 2D перенесли на мембрану PVDF ImmobilonP (Millipore, Billerica, США) і заблокували на 1 годину 5% BSA та 0,05% TWEEN20, після чого інкубували протягом ночі при 4 ° C з розведеними сироватками крові 1:20. Імунореактивні білки виявляли за допомогою козячого антитіла, кон'югованого з пероксидазою IgA людини (Sigma-Aldrich-A0295), у присутності хромогенного пероксидазного субстрату 4-хлор-1-нафтолу. Білкові плями з імунною відповіддю вирізали та подали на ідентифікацію білка за допомогою онлайн-нано-LC-MS/MS. Рисове антитіло до глютеліну разом з IgA проти кролика як вторинне антитіло використовували в 2D-аналізі вестерн-блот для підтвердження присутності глобулінів для зберігання насіння 14 .

Ідентифікація білка за допомогою нано-LC-MS/MS онлайн

Аналіз послідовності та прогнозування епітопів

Результати

глобуліну

( ДО ) - 2D гель-електрофорез загального білкового екстракту інбредної лінії Bd21. Білки відокремлювали на смужках IPG 3-10 рН з подальшим поділом на 12% акриламідних гелях. Помічені білкові плями представляють імунореактивні білки і були подані на онлайн-аналіз nanoLC-MS/MS. Діапазон молекулярної маси позначений зліва. ( B до F ) - репрезентативні імуноблоти, що використовують реактивні сироватки IgA від наївних хворих на целіакію ( B - HLA DQ2, C. - HLA DQ8, D - HLA DQ8/X), терапія страждала на хворому ілеоколіком хворобою Крона ( І ), Хворий на целіакію HLA DQ2 з безглютеновою дієтою та здоровим контролем ( G ). H: Вестерн-блот-аналіз загального білкового екстракту проводили з використанням рисового глютеліну 12 та антитіл кролика IgA (Sigma-Aldrich) як вторинного антитіла.

Повнорозмірне зображення

Повний розмір таблиці

Два плями глобуліну 7S (Uniprot ID I1GPS5 та I1GMC8) були переважно ідентифіковані з плям. I1GPS5 було визнано основним влученням 14 білкових точок. Цей білок продемонстрував найбільшу схожість з гомологами білків зберігання пшениці Globulin-3 та Globulin-3A (Uniprot ID B7U6L4 та I6QQ39). I1GMC8 був виявлений у двох білкових плямах і продемонстрував найбільшу подібність послідовності з глобуліновим 1S-подібним білком, виявленим з Triticum urartu (M7ZQM3). Білок брахіподію I1HNH9 показав найвищу гомологію з 11S глобуліном (A. sativa Q38780). Білки I1HMK7 та I1IPF2 були ідентифіковані як 12S глобуліни, з найсильнішою подібністю до білків зберігання насіння 12S у A. sativa (P12615 та P14812). Сироватки частіше реагували на гомолог білка зберігання пшениці Глобулін-3А (69,23% - I1GPS5) та глобулінів типу 11S та 12S (76,92% - I1HNH9 та I1HMK7). Подібний гомолог низькомолекулярному глютеніну (69,23% I1HMR6) також був високореактивним імунітетом до сироваток пацієнтів з целіакією.

Щоб перевірити наявність глобулінів, що зберігають насіння, в імунно-реактивних білкових плямах, проводили Вестерн-блот-аналіз з використанням первинних антитіл, специфічних для рисових глютелінів, рисових гомологів глобулінів 11S для зберігання насіння (рис. 1Н). Сильні сигнали глобуліну були виявлені з білкових плям ID 1-14 та 22-28.

Найважливіші потрапляння глобуліну (I1GPS5, I1GMC8, I1HMK7, I1IPF2 I1HNH9), а також найбільш часто ідентифікований білок проламіну (I1HRM6) були піддані прогнозуванню структури за допомогою аналізу послідовності кремнію. Два характерні суміжні домени купін-1 були знайдені в глобулінах для зберігання насіння 7S та 11S-12S у всіх потрапляннях глобуліну брахіподіум (рис. 2). Регіони з можливою здатністю зв'язування з асоційованими структурованими білками були виявлені 22 у більшості аналізованих білків глобуліну. Регіони сильного зв'язування були розташовані на межі впорядкованих невпорядкованих областей у глобулінах типу 7S (I1GPS5 та I1GMC8), тоді як у глобулінах 11S та 12S були виявлені значно слабкіші ділянки зв'язування, а області аналізу брахіподію . послідовність. (Малюнок 2)

Повнорозмірне зображення

Було виявлено десять довгих амінокислотних пептидів з більш ніж 70% гомологією послідовності зі специфічними для В-клітин лінійними епітопами глютену в безпосередній близькості до зв’язуючих з білками I1GPS5 областей (Таблиця 2). Ідентифіковані гомологи епітопів представляли пептиди з розтягуванням polyQ і розташовувались у двох багатих глутаміном областях білка. Крім того, було виявлено шість залишків пептиду (QPEQPF) у глобуліні для зберігання насіння 11S, I1HNH9. Цей пептид був дезамідованою версією відомого імунореактивного AGA-специфічного B-клітинного епітопу QPQQPF (IEDB Epitope ID 147232), який дезамідується під час процесу целіакії. Ця незв’язана версія являє собою одну з основних цілей для антитіл до DGP у сироватці крові при целіакії. Цікаво, що жоден з гомологів I1HNH9 Poaceae не містив цього дезамідованого пептиду. У білках, пов’язаних із метаболізмом, не виявлено гомологів епітопів.

Повний розмір таблиці

Відбір прогнозованих в'яжучих речовин проводився з використанням в'яжучих речовин, що перевищують 1% на основі консенсусних значень рангового процентилю. Прогнози розраховували для кожного алеля окремо. Прогнозовані епітопи наносяться на білкові послідовності.

Повнорозмірне зображення

Модель третинної структури мономеру глобуліну I1GPS5 7S була побудована з використанням загальнодоступних кристалічних структур 7S глобулінів, виділених із рослин. Ідентифіковані специфічні для глютену гомологи В-клітинних епітопів, які мають послідовність приблизно 350 амінокислот, були зіставлені в безпосередній структурній близькості. Один із гомологів В-клітинних епітопів знаходиться на зовнішній поверхні бета-бочки, утвореної другим доменом купін-1. Прогнозовані HLA-DQ-специфічні епітопи Т-клітин та ідентифікований епітоп діабету типу I були розташовані на протилежному ділянці молекули білка, яке також могло піддаватися дії травних ферментів (рис. 4А, В, С). У випадку з глобуліном I1HNH9, що зберігає насіння, передбачуваний епітоп DQ2 знаходився у прихованому положенні, тоді як гомолог В-клітинного епітопу QPEQPF знаходиться на поверхні білка (рис. 4D та E).

Мономерні глобулінові структури моделювались із використанням загальнодоступних рослинних ортологів як структурних шаблонів та сервера білка I-Tasser, що передбачає структуру функцій. Положення ідентифікованих клейковинних гомологів В-клітинних епітопів та передбачуваних HLA DQ2 та DQ8-специфічних Т-клітинних епітопів були відображені у структурі. ( ДО - C. ) I1GPS5; ( D, І ) I1HNH9.

Повнорозмірне зображення

Обговорення

На підставі наших попередніх досліджень, велика кількість білків зернових злаків може містити пептиди, багаті проліном та глутаміном, що робить їх мішенню для клітин, що представляють антигени, пов'язані з целіакією та імуноглобулінами 10, 15, 24. У пшениці більшість цих білків належать до надсімейства проламіну і є природною сполукою пшеничної клейковини. Однак є деякі білки непроламінного типу, які також містять пептиди, ідентичні або дуже схожі на специфічні для глютену 10,15 Т- і В-клітинні епітопи.

Наше дослідження підтвердило, що білки для зберігання зерна типу глобуліну специфічно пов’язані з целіакією, оскільки пацієнти, які страждають на інші запальні та імунні захворювання, такі як хвороба Крона, не розпізнавали ці білки, що зберігаються в зернах, із типу глобуліну. Несприятливі результати імуноблот-аналізу із сироватками крові на хворих на целіакію на безглютеновій дієті також підкріпили припущення, що глобуліни, що зберігають насіння, можуть діяти як вторинні стимулятори В-клітин завдяки своїй сильній гомології послідовності до епітопів, спричинених первинними активаторами глютену. На прогресуючих стадіях захворювання волосиста атрофія та підвищена проникність кишечника сприяють тому, що ці білки можуть служити перехресними антигенами. Слизова оболонка кишечника, яка відновлюється у хворих на целіакію на суворій безглютеновій дієті, перешкоджає проходженню проглочених білків і, можливо, таким чином можна контролювати сильну імунну реактивність.

$ config [ads_text16] не знайдено

Висновки

Додаткова інформація

Як цитувати цю статтю: Гелл, Г. та співавт. Характеристика білків, що зберігають глобулін, для злакових з низьким рівнем проламіну щодо целіакії. Науковий співробітник. 7, 39876; doi: 10.1038/srep39876 (2017).

Примітка редактора: Springer Nature залишається нейтральним щодо юрисдикційних вимог щодо опублікованих карт та інституційних приналежностей.