tlr2

  • Резюме
  • Мета:
  • Методи:
  • Результати:
  • Завершення:
  • Вступ
  • Матеріали і методи
  • Тварини та експериментальний дизайн.
  • Збір і обробка тканин.
  • Біохімічний аналіз
  • Гістологічне та імуногістохімічне фарбування.
  • Аналізи маркування нікелевим dUTP, опосередкованим TdT на місці
  • Вестерн-ляпси
  • статистичний аналіз
  • Результати
  • Блокування активності TLR2 зменшує і стабілізує атеросклеротичні ураження в брахіоцефальній артерії
  • Блокада TLR2 послаблює запалення в атеросклеротичних артеріях
  • Блокада TLR2 зменшує апоптоз макрофагів та експресію CHOP при поширених атеросклеротичних ураженнях
  • TLR2 опосередковує прискорене утворення атеросклерозу та регулює експресію CHOP та апоптоз у мишей з дефіцитом ApoE, які харчуються HC
  • Обговорення
  • Внесок автора

Резюме

Мета:

Сигналізація про рецептор 2 (TLR2) відіграє вирішальну роль у ініціюванні атеросклерозу. Метою цього дослідження було дослідити, чи може блокування активності TLR2 мати терапевтичний ефект на атеросклероз, що розвивається.

Методи:

Сорокатижневому віку мишам з дефіцитом аполіпопротеїну Е (ApoE -/-), яких годували нормальним раціоном, внутрішньовенно вводили нейтралізуюче антитіло до TLR2 або сумісний з ізотипом IgG протягом 18 тижнів. ApoE -/- Tlr2 -/- подвійно потрапили миші були взяті як позитивний контроль. Наприкінці процедур вимірювали рівень ліпідів у плазмі та аналізували морфологію нальоту, експресію прозапального цитокіну та апоптоз в артеріях. У другій частині цього дослідження 6-тижневі миші ApoE -/- і ApoE -/- Tlr2 -/- годували дієту з високим вмістом холестерину протягом 12-24 тижнів, рівні експресії TLR2 та апоптотичні маркери в артеріях були обстежили.

Результати:

Блокування активності TLR2 за допомогою нейтралізуючого антитіло TLR2 або інактивація гена Tlr2 не змінило рівні ліпідів у плазмі крові у мишей ApoE -/-. Однак фармакологічні та генетичні маніпуляції значно зменшили розмір нальоту та стеноз судин та підвищили стабільність нальоту в брахіоцефальних артеріях. Захисні ефекти антагонізму TLR2 були пов'язані з пригніченою експресією прозапальних цитокінів IL-6 та TNF-α та інактивацією факторів транскрипції NF-κB та Stat3. Крім того, блокування активності TLR2 послаблює викликаний стресом апоптоз макрофагів в брахіоцефальних артеріях, що може сприяти розрідженню некротичних ядер при атеросклерозі. Крім того, дієта з високим рівнем холестерину прискорила атеросклеротичне формування та збільшила експресію і апоптоз білка CHOP і апоптоз у мишей ApoE -/-, ніж у мишей ApoE -/- Tlr2 -/- .

Завершення:

Фармакологічне або генетичне блокування активності TLR2 зменшується та стабілізує розвинені атеросклеротичні ураження у мишей ApoE -/-. Тому націлювання на передачу сигналів TLR2 може бути перспективною терапевтичною стратегією проти атеросклерозу, що розвивається.

Вступ

Атеросклероз - часта причина серцево-судинних захворювань. Серцево-судинні захворювання є основною причиною смерті та представляють зростаючу загрозу здоров'ю людей у ​​всьому світі 1. Епідеміологічні та експериментальні дослідження встановили переважну роль запалення на всіх стадіях атеросклерозу, від утворення ранніх стабільних атеросклеротичних бляшок до запущених бляшок, схильних до розривів 2, 3, 4, 5. Нещодавно кілька досліджень зосереджувались на впливах фармакологічних втручань на стабільність запущених бляшок, оскільки розрив нестабільних вогнищ сприяє розвитку гострого коронарного синдрому 4, 6, 7. Нестійкі бляшки характеризуються великими заповненими ліпідами некротичними ядрами, інкапсульованими тонким волокнистим шаром, високим рівнем прозапальних медіаторів та матриксних протеаз та апоптозом. Розвиток нестабільних бляшок пов’язано з участю вродженої та пристосувальної імунної системи.

Толлоподібні рецептори (TLR) - це сімейство рецепторів розпізнавання образів, які відіграють ключову роль у вродженому імунітеті та ініціюють запальні реакції. Лігування цих рецепторів ініціює активацію ядерного фактора κB (NF-κB), що призводить до експресії широкого спектра запальних генів 8, 9. Серед TLR, що характеризуються, TLR2 є унікальним завдяки своїй здатності гетеродимеризуватися з TLR1 або TLR6, що призводить до відносно широкої специфічності ліганду, що включає як ендогенні, так і екзогенні ліганди. Примітно, що всі потенційні ендогенні агоністи TLR2, включаючи біглікан, високомобільний хромосомний білок 1 (HMGB1) та окислені ліпопротеїнові компоненти, виявляються в атеросклеротичних ураженнях 12, 13, 14. Крім того, сигнальний шлях TLR2 пов'язаний із реакцією на стрес ендоплазматичної сітки (ER). Стрес ER може збільшити експресію TLR2 in vitro та in vivo, а TLR2 сприяє апоптозу в макрофагах, які зазнають стресового ER-стресу. Тому TLR2 може бути потенційною мішенню для терапевтичних втручань при лікуванні атеросклерозу.

Матеріали і методи

Тварини та експериментальний дизайн.

Мишей ApoE -/- Tlr2 -/- генерували з гетерозиготних кросоверів мишей ApoE -/- (фон C57BL/6, лабораторія Джексона) та мишей Tlr2 -/- (фон C57BL/6, лабораторія Джексона). Генотипи гомозиготних подвійних нокаутів або мишей з одноразовим нокаутом ApoE були підтверджені за допомогою ПЛР, як описано раніше 18. Усі тварини утримувались у стандартних умовах вологості, кімнатної температури та темних світлових циклів, з доступом до води та їжі за бажанням. Дослідження проводились відповідно до принципів, викладених Інституційним комітетом з етики догляду за тваринами та лікування в біомедичних дослідженнях (Пекін, Китай).

Збір і обробка тканин.

Після того, як миші голодували протягом 4 год, через ретроорбітальне венозне сплетення отримували кров для вимірювання ліпідів. Потім мишей знеболювали, використовуючи 50 мг/кг внутрішньовенно внутрішньовенно, пентобарбіталу і перфузували через лівий шлуночок серця крижаним сольовим розчином, забуференним фосфатом, під фізіологічним тиском. Аорти швидко вирізали, швидко заморозили від дуги аорти до роздвоєння клубової кістки і тримали при -80 ° C до аналізу білка. Вся брахіоцефальна артерія кожної тварини була зафіксована в 4% параформальдегіді протягом 24 годин при 4 ° C, вкладена в парафін і розділена серійно (товщина 5 мкм).

Біохімічний аналіз

Рівні загального холестерину, холестерину ліпопротеїнів високої щільності (HDL-C), холестерину ліпопротеїдів низької щільності (LDL-C) та тригліцеридів у плазмі визначали за допомогою комерційних наборів (Biosino, Пекін, Китай) відповідно до інструкцій виробника. .

Гістологічне та імуногістохімічне фарбування.

Кожну п'яту ділянку серійних зрізів фарбували модифікованою пентахромною плямою Мовата або червоним Сіріусом, щоб оцінити склад і стабільність розвинених атеросклеротичних бляшок в брахіоцефальній артерії, а для кожної плями аналізували 12-15 зрізів на мишу. Пофарбовані зрізи сфотографували зі збільшенням 200 ×, і 2-3 поля зору на зріз, що містить всю область ураження, були захоплені та проаналізовані за допомогою Image-Pro Plus 5.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). Середнє значення всіх зрізів представляло атеросклеротичне ураження миші.

Для імуногістохімічного фарбування принаймні 4 ділянки брахіоцефальної артерії на миші інкубували з антимишачим антитілом до миші (щури) (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), моноклональним антитілом миші для гладкої мускулатури актин (α-SMA, 1: 100, Санта Круз Біотехнологія, Каліфорнія, США), або антитіло кролика проти матриксної металопротеїнази (MMP) -2 (1: 100, Abcam, Кембридж, Великобританія). Зв’язані антитіла комплексували з пероксидазозв’язаними вторинними антитілами та виявляли за допомогою діамінобензидину. Забруднені зрізи фотографували зі збільшенням 200 ×, і 2-3 поля зору, що містять всю площу ураження на зріз, були захоплені та проаналізовані за допомогою Image-Pro Plus 5.0. Середнє значення всіх зрізів представляло експресію цільових білків при атеросклеротичному ураженні.

Для оцінки колокації макрофагів та гомологічного білка C/EBP (CHOP), антитіл до мишей макрофагів щурів (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) І моноклональних антитіл миші до CHOP (1 (100, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) використовувались як первинні антитіла. Чотири зрізи тканини на миші інкубували з міченими Alexa 647 курячими щурами та міченими Alexa 488 кролячими проти мишачими вторинними антитілами (1: 200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Зрізи знімали за допомогою конфокального мікроскопа E2000U та оцінювали за допомогою програмного забезпечення Leica TCS SP2.

Аналізи маркування нікелевим dUTP, опосередкованим TdT

Апоптотичні клітини при атеросклеротичних ураженнях виявляли за допомогою TdT-опосередкованої техніки нік-енд-маркування dUTP (TUNEL) за допомогою наборів (Promega, Madison, WI, USA). Ядра фарбували DAPI. TUNEL-позитивні ядра підраховували під інвертованим флуоресцентним мікроскопом Olympus I720. Для оцінки колокації макрофагів макрофаги були виявлені за допомогою антитіл до мишей до макрофагів щурів (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) з подальшим курячим анти-щурячим вторинним антитілом. (1: 200, Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США).

Вестерн-ляпси

Після гомогенізації тканин екстраговані білки відокремлювали за допомогою 12% SDS-PAGE та імуноблотували специфічною акулою, включаючи анти-MMP-2 (Abcam, Кембридж, Великобританія), анти-фосфо-NF-κB p65, anti-NF -κB p65, антирозщеплена каспаза-3, анти-CHOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, США), анти-фосфо-Stat3, анти-Stat3, анти-інтерлейкін (IL) -6, анти-IL-10 або анти -фактор некрозу пухлин (TNF) -α (Санта Круз Біотехнологія, Каліфорнія, США). Вторинні сигнали антитіл виявляли за допомогою реактивів ECL Plus Western Blot (Amersham Biosciences, PA, США) відповідно до інструкцій виробника.

статистичний аналіз

Дані представлені як середнє значення ± SEM. Порівняння між різними групами проводили за допомогою одностороннього ANOVA з використанням SPSS. Дані, які не демонструють нормального розподілу, аналізували за допомогою U-критерію Манна-Уітні. P

Блокування активності TLR2 не впливає на рівень ліпідів у плазмі крові. Загальний рівень холестерину (A), тригліцеридів (B), LDL-C (C) та HDL-C (D) визначали у 58-тижневих мишей ApoE -/-, які отримували фізіологічний розчин, IgG або iv TLR2ab протягом 18 років. тижнів та у мишей ApoE -/- з дефіцитом TLR2 (DK), які харчувались дієтою Чау. Дані відображаються як середнє значення ± SEM (n = 12 мишей/група).

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Блокування TLR2 зменшує і стабілізує розвинені атеросклеротичні бляшки в брахіоцефальній артерії. (A та B) Фарбування Movat показало склад запущених уражень груп, оброблених фізіологічним розчином, IgG та TLR2ab та дефіцитом TLR2. Стрілки вказують на ерозію засобів масової інформації. Шкала шкал являє собою 200 мкм на панелі A і 50 мкм на панелі B. Введення TLR2ab протягом 18 тижнів і дефіцит TLR2 значно зменшує середню площу ураження (C), максимальний стеноз ураження (D), максимальну кількість некротичних ядер/бляшки (E), і мінімальна середня товщина (F) у мишей з дефіцитом ApoE. L, просвіт; М, ЗМІ. Дані відображаються як середнє значення ± SEM (n = 10 мишей/група). b P

Блокада TLR2 стабілізує розвинені атеросклеротичні бляшки. У групах, які отримували TLR2ab та не мали дефіциту TLR2, фарбування Сіріусом червоним виявило більший вміст колагену (A). Імуногістохімічне фарбування виявило більш рясний розподіл клітин гладкої мускулатури (В) та зменшення накопичення макрофагів (С) при ураженнях брахіоцефальної артерії. Шкали шкали представляють 50 мкм. L позначає світло. Дані відображаються як середні значення ± SEM (n = 10 мишей/група). b P c P

Блокування TLR2 пригнічує запалення судин в атеросклеротичних артеріях. Експресія MMP-2 (A і B), фосфорилювання NF-κB p65 (C), фосфорилювання Stat3 (D) та експресія цитокінів IL-6, TNF-α та IL-10 (E) вони були зменшені в групах, які отримували TLR2ab та дефіциті TLR2. Шкали шкали представляють 50 мкм. Дані відображаються як середнє значення ± SEM (n = 6 мишей/група). b P

Дієти з високим вмістом холестерину (СН) збільшують експресію TLR2 в макрофагах, а блокування TLR2 зменшує експресію CHOP, індуковану СН і апоптозом при атеросклеротичних ураженнях. (A) Забарвлення Моват виявило морфологію нальоту в брахіоцефальних артеріях мишей ApoE -/- Tlr2 +/+ та ApoE -/- Tlr2 -/-. Шкали шкали представляють 200 мкм. Дефіцит TLR2 значно зменшив середні площі ураження (B) та розміри некротичних ядер (C) (n = 8 мишей/група). (D) Подвійна імунофлюоресценція виявила інфільтрацію макрофагів, що експресують TLR2, у ураження брахіоцефальної артерії мишей ApoE -/- віком 12-24 тижнів, які отримували атерогенні дієти, починаючи з 6-тижневого віку. Шкали шкали представляють 20 мкм. У зазначені вікові періоди миші ApoE -/- Tlr2 -/- демонстрували CHOP (E), Bcl-2 (F) та значно розщеплювали експресію каспази-3 (G) в аортах. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 4-6 мишей/група). b P -/- в тому ж віці. e P -/- 12-тижнева дієта чау.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Обговорення

Запальні процеси відіграють фундаментальну роль у розвитку атеросклерозу. Показано, що TLR2 бере участь у цьому процесі 11, 27. Відповідно до попередніх досліджень на ранніх стадіях атеросклерозу, блокування активності TLR2 зменшило інфільтрацію макрофагів із бляшок; експресія медіаторів запалення, включаючи MMP-2, TNF-α та IL-6; і інактивація фактора транскрипції NF-κB 20, 21, 23. Крім того, антагонізм TLR2 також пригнічував експресію імунодепресивних медіаторів IL-10 та фактора транскрипції Stat3, вказуючи на те, що переваги блокування TLR2 залежать від значного гальмування запалення. Це дослідження пропонує перші докази TLR2-індукованого запалення при запущених ураженнях, яке доповнює раніше виявлену сприяючу роль TLR2 у ранньому атеросклерозі.

Нестабільність нальоту є важливою особливістю перенесеного атеросклерозу. Хоча механізми, що лежать в основі розриву бляшок, залишаються незрозумілими, було показано, що багато факторів сприяють цьому процесу, включаючи накопичення макрофагів, високий рівень прозапальних медіаторів, надмірну активацію ММР та апоптоз VSMC та макрофагів. На додаток до регулювання запальних реакцій, ми спостерігали, що блокада TLR2 зменшує апоптоз макрофагів за допомогою аналізу TUNEL та імунофлюоресценції.

Підводячи підсумок, ми показали, що інактивація гена TLR2 у мишей ApoE -/- зменшує розмір бляшок та підвищує стабільність бляшок у брахіоцефальній артерії під час атеросклерозу в результаті інгібування запалення та апоптозу. Зокрема, лікування цих мишей нейтралізуючими антитілами TLR2 призводило до корисних терапевтичних ефектів і може слугувати перспективною терапевтичною стратегією проти атеросклерозу. Оскільки для ініціювання захворювання в ендотеліальних клітинах необхідна посилена експресія TLR2, TLR2 може опосередковувати або посилювати індуковані стресом апоптотичні сигнали ER при атеросклеротичних поразках. Наша робота припускає, що фармакологічне блокування сигналізації TLR2 є привабливим підходом для майбутнього лікування атеросклерозу.

Внесок автора

Xiao-xing WANG та Zhuo-wei HU розробили дослідження; Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV та Hui-min YAN сприяли розробці методології; Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV, Jia-ping WANG, Hui-min YAN, Zi-yan WANG, Han-zhi LIU та Xiao-ming FU проводили експерименти; Xiao-xing WANG та Zhuo-wei HU проаналізували дані та написали статтю.