Скринінг на муковісцидоз був запроваджений у Словаччині з + 9. 2009. Принцип методу полягає у визначенні імунореактивного трипсиногену (IRT) у сухій краплі крові за алгоритмом IRT/IRT, тобто двоступеневому визначенні рівня IRT. Трипсиноген - це білок підшлункової залози - неактивний попередник трипсину, який потрапляє в кров через закупорку підшлункових проток при МВ. Гранична межа для першої проби (IRT/1) у пробі, взятій на 72-96 годинах життя, становить 70 нг/мл (99-й процентиль), а для другої проби (IRT/2) між 14-21 добою життєве значення 60 нг/мл. Етнічне походження дитини також повинно враховуватися при загальнодержавному скринінгу новонароджених на МВ. Досвід Національного референтного скринінгового центру показав, що новонароджені роми часто мають хибнопозитивні результати скринінгу та значно вищі рівні IRT (до 34%) порівняно з більшістю населення. Тому для етнічної групи ромів граничне значення для IRT/1 було збільшено до 84 нг/мл, а для IRT/2 - до 72 нг/мл (4). Подібна ситуація зафіксована в США щодо афроамериканських дітей.

діагностика

У всьому світі при скринінгу муковісцидозу повідомляли про помилкові негативні показники від 5 до 9% (2,3), тому, маючи відповідні клінічні дані, слід враховувати можливість розвитку МВ у дітей, які пройшли скринінг новонароджених із негативними результатами. Повідомлялося про неспецифічне підвищення рівня IRT у новонароджених із перинатальною асфіксією та може призвести до помилкової позитивності. Через скринінг новонароджених середній вік при діагностиці захворювання зменшився до 6-8 тижнів порівняно з 14 місяцями до введення скринінгу (3). Виявлення пацієнтів з неонатальним скринінгом МВ та раннє лікування призводить до значно кращого прогнозу.

МВ є поліорганною хворобою, симптоми захворювання можуть виражатися різною інтенсивністю у кожного пацієнта і вражати різні органи. У новонародженому віці близько 1/5 дітей з МВ мають т.зв. меконієвий ілеус. Типовими синопульмональними симптомами є хронічний риносинусит, поліпоз носа, ателектази, бронхоектатична хвороба, ключки пальців, стійкі інфекції збудниками, типовими для МВ та легеневого мікобактеріозу, пневмоторакс, кровохаркання та алергічний бронхолегеневий аспергільоз. У проявах поза дихальними шляхами переважають шлунково-кишкові розлади: меконієва кишка, екзокринна недостатність підшлункової залози та рецидивуючий панкреатит, цукровий діабет, синдром гастроезофагеального рефлюксу, синдром дистальної кишкової непрохідності, жовчний цироз печінки, жовчнокам'яна хвороба, жовчнокам'яна хвороба, розчинний у жирі (A, D, D, К). Порушення в мінералограмі та кислотно-лужному балансі є важливими симптомами МВ. При гострій гіпонатріємічній дегідратації виникають анорексія, блювота, втрата ваги з ризиком розвитку розладу свідомості та судом. Хронічний метаболічний алкалоз з гіпокаліємією описаний у дорослого пацієнта як перша ознака муковісцидозу (5).

Тест на піт призначений для клінічної суспензії або позитивного/прикордонного скринінгу новонароджених. Цей тест заснований на визначенні концентрації хлориду в поті за допомогою іонофорезу пілокарпіну та має чутливість близько 95%. Значення вище 60 ммоль/л є діагностичними для МВ, значення 30 - 59 ммоль/л називаються граничними, і діагноз МВ можливий, при значеннях нижче 30 ммоль/л КФ малоймовірний. Випробування та його лабораторна оцінка повинні проводитися відповідно до мінімальних стандартів, встановлених (1). Згодом на першому етапі за замовчуванням вказується молекулярно-генетичне дослідження гена CFTR, досліджується група мутацій, найбільш поширена в даній популяції. (Таблиця 1).

Клінічні одиниці з дисфункцією CFTR, які не відповідають клінічним критеріям муковісцидозу, в сукупності називаються розладами, пов'язаними з CFTR (CFTR-Rds) (6). Відповідно до діючих на сьогодні рекомендацій Фонду муковісцидозу від 2017 року, визначено три порушення, пов’язані з CFTR: рецидивуючий панкреатит, вроджений двосторонній семяпровідний вік (CBAVD) та хронічний набутий бронхоектатичний напад (7).

Для випадків позитивного скринінгу новонароджених та проміжних значень тесту на піт у США використовується термін метаболічний синдром, пов'язаний з регулятором трансмембранної провідності (CRMS), який накладається на одиницю позитивного екрану CF, позитивний діагноз на екрані (позитивний екран на екрані, безрезультатний діагноз), CFSPID), що використовується в інших країнах. У більшості дітей з розладами, пов'язаними з CFTR, не розвивається картина муковісцидозу в перші роки життя. Однак МВ розвивається невеликою часткою, і дані про довгостроковий прогноз цих пацієнтів поки відсутні (8,9).

CFTR-RD і CRMS/CFSPID замінюють розмиті позначення атипових, некласичних або пізніх CF, використовуваних раніше.

Ген CFTR

Ген, відповідальний за МВ, називається CFTR (трансмембранний регулятор провідності муковісцидозу). Він знаходиться на 7q31,2, довжиною 250 кб, складається з 27 екзонів довжиною від 38 п.н. до 724 п.н. (10). Ген кодує мРНК розміром 6,5 кб, яка транскрибується в поліпептид з 1480 амінокислот.

За фізіологічних обставин CFTR є трансмембранним білком, який функціонує як хлористий канал з регуляторною функцією для деяких інших іонних каналів. Він складається з п'яти функціональних доменів, двох трансмембранних доменів TMD1 та TMD2, двох ATP-зв'язуючих доменів NBD1 та NBD2 та одного великого регуляторного домену R, який з'єднує дві половини поліпептиду. Білок CFTR закріплений у ліпідному бішарі секреторних клітин, орієнтований на цитоплазму (малюнок 1).

В даний час описано майже 2000 варіантів гена CFTR, з яких понад 1200 є патогенними. База даних консорціуму генетичного аналізу муковісцидозу CFGAC (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr) містить поточний стан варіантів CFTR. Переважна більшість варіантів зустрічається дуже рідко, і їх поширення обмежується невеликими ізольованими популяціями. Тільки 30 варіантів гена CFTR зустрічаються із часткою більше 0,1%.
Найбільш поширеним варіантом гена CFTR і першим ідентифікованим (12) є F508del (також званий дельта-F508, скорочено ∆F508). Це викликано делецією трьох основ в екзоні 11 гена CFTR, що призводить до втрати однієї амінокислоти - фенілаланіну в білку CFTR в положенні 508. Отриманий білок є нефункціональним. Частка цього варіанту в Словаччині становить від 59,4 до 66,8% (13).

Представлення різних варіантів в окремих функціональних областях CFTR є нерівномірним. Збільшення кількості варіантів спостерігалось у доменах R та NBD1. Різні типи варіантів по-різному впливають на перебіг захворювання. Наслідком широкого спектру варіантів гена CFTR є велика фенотипова мінливість CF, якій також сприяє вплив зовнішнього середовища та генетичного фону особини.

Механізми впливу різних варіантів на функціональність білка CFTR можна розділити на 5 груп:

  1. Білок CFTR не утворюється або лише незначна кількість через передчасне припинення трансляції через передчасні стоп-кодони: G542X, 621 + 1G> T, 390insT.
  2. Порушення посттрансляційних модифікацій, які призводять до передчасної деградації поліпептидів: напр. F508del, N1303K,
  3. Порушення регуляції, спричинені конформаційними змінами білка CFTR: G551D, G551S, S1255P.
  4. Порушення провідності хлоридного каналу: напр. R117H, R334W,
  5. Знижений рівень транскрипту мРНК, а згодом і білка: 3849 + 10kbC> T, 1811 + 1,6kbA> C

Молекулярно-генетичний аналіз проводиться із зразка периферичної крові, взятого в стерильну пробірку ЕДТА. Молекулярна діагностика МВ грунтується на виявленні причинно-наслідкових варіантів, але існування майже 2000 варіантів, розкиданих по всьому гену CFTR, може спричинити помилково негативний результат. Мультиплексна алель-специфічна ПЛР досліджує 67 варіантів гена CFTR, що становить понад 90% усіх варіантів CF у нашій популяції. (Таблиця 1).

Такі методи, як dHPLC (денатурація високоефективної рідинної хроматографії), HRM (плавлення з високою роздільною здатністю) або секвенування цілих генів використовуються для аналізу всього гена CFTR.

Показання до молекулярно-генетичного аналізу гена CFTR (модифікований згідно з 14):

  1. Діагностичне тестування на типові прояви МВ, атипові клінічні прояви та/або пороги тесту на піт, чоловіче безпліддя з CBAVD та інші CFTR-RD у дорослих.
  2. Пренатальна діагностика (наприклад, у разі носія мутацій CFTR, під час вагітності з підтвердженою МВ у одного з батьків або у плода з гіперехогенною кишкою та/або дилатацією кишкової петлі).
  3. Тест на носійство на МВ у осіб з позитивною сімейною історією. У деяких країнах тестування на носії на МВ також запроваджується у осіб без позитивного сімейного анамнезу в рамках обстеження на носії на найпоширеніші генетичні захворювання або у безплідних пар (не поширюється на Словацьку Республіку).

На сьогоднішній день генетика є сферою, яка суттєво змінює наш погляд на патофізіологію хвороб. Муковісцидоз, як відносно поширене захворювання, досить детально вивчається з молекулярно-генетичної точки зору. Після підтвердження самого клінічного діагнозу ми переходимо до скринінгу новонароджених, пренатальної діагностики, визначення статусу носія у безсимптомних осіб або доімплантаційної діагностики ембріонів. Крім того, визначення наявності специфічних мутацій дозволяє нам вибрати найбільш ефективне лікування. Таким чином, муковісцидоз стає модельним захворюванням і показує нам потенціал генетичної діагностики навіть при менш поширених моногенних захворюваннях.

ЛІТЕРАТУРА