реферат

Фотоокиснення полівітамінних розчинів призводить до утворення пероксидів. Оскільки пероксиди пов'язані зі стеатозом і фіброзом печінки, а також холестазом, ми запитали, чи беруть участь полівітаміни в ускладненнях печінки при парентеральному харчуванні. Цуценята морських свинок класифікували як таких, що отримували внутрішньовенно або загальне парентеральне харчування, або фотозахисне, або контрольний розчин (5% декстрози + 0,45% NaCl), доповнений або а) полівітамінами; б) полівітаміни, захищені від світла; в) полівітаміни без рибофлавіну; або г) пероксиди (H 2 O 2, трет-бутил гідропероксид). Через 4 дні відбирали зразок печінки для гістологічного дослідження та рівня ізопростану-F2a, маркера радикальної атаки. Полівітаміни, а також загальне парентеральне харчування асоціюються зі стеатозом (оцінка 0-4), ступінь вираженості якого зменшена (р + і Cu + за допомогою реакцій Фентона/Хабер-Вейса). Радикали, отримані з пероксидів, що утворюються в розчинах TPN ( 12).

Метою цього дослідження була оцінка ролі полівітамінів у печінкових ускладненнях, пов’язаних з TPN, як це зафіксовано гістологією, та відокремлення ефекту світла від впливу пероксидів та/або вільних радикалів.

методи

Тварина модель.

Під кетаміном/ксилазином 3-денні морські свинки (річка Чарльз, Монреаль, Квебек, Канада) були встановлені 0,4 мм поліуретановим катетером (Luther Medical Products, Tustin, CA, USA) у зовнішню яремну вену та екстеріоризовані в лопаткова область. Катетер був з'єднаний з потоковою системою, що дозволяла тваринам рухатися, які розміщувались окремо в пластикових коробках із дном із дротяної сітки. Тварин утримували в теплому контрольованому середовищі з 12-годинним циклом світло/темрява і годували виключно внутрішньовенно 240 мл/кг/добу. Через 4 дні тварин забивали, а печінку аліквотували зразками, які зберігали у формі гістологічного дослідження або перетирали та зберігали при -80 ° C до аналізу тригліцеридів та ізопростанів, що є показником радикальної атаки (17). Дослідження проводили згідно з рекомендаціями Інституційного комітету з питань тварин.

Ця модель тварини була обрана завдяки попередньому неопублікованому спостереженню стеатозу печінки у щенят морських свинок. Потрібно було повторити ті самі експериментальні умови, щоб переконатись, що цей стеатоз можна запобігти за допомогою фотозахисту.

Протоколи.

Щоб відокремити дію полівітамінів та світла, тваринам вливали один із наступних режимів, що містить розчин полівітамінів у концентрації, подібній до тієї, що використовується при парентеральному харчуванні новонароджених. Фотозахист досягався підготовкою розчинів у темряві та покриттям інфузійного набору непрозорим матеріалом та використанням фотозахищеної внутрішньовенної трубки (13), люб’язно наданої Baxter Canada.

MVP + світло: 1% (об/об) MVP (Sabex, Boucherville, Квебек, Канада), незахищений від навколишнього світла, розведений у контрольному розчині (50 г/л декстрози + 4,5 г/л NaCl + 1 одиниця гепарину/мл); 5 мл MVP містить: вітамін А, 2300 ОД; вітамін D, 400 МО; α-токоферол, 7 МО; вітамін К, 200 мкг; аскорбат, 80 мг; тіамін, 1,2 мг; рибофлавін, 1,4 мг; піридоксин, 1,0 мг; пантотенат, 5 мг; фолат, 0,14 мг; ціанокобаламін, 1 мкг; нікотинамід, 17 мкг; біотин, 20 мкг; і добавки манітолу та полісорбату як емульгатори.

MVP - легкий: 1% (v/v) MVP фотозахищений, розведений у контрольному розчині.

TPN + світло: Два розчини, не захищені від навколишнього світла, вливали в "свинячому" компоненті поблизу місця інфузії: а) контроль + 9,6 г/кг/день амінокислот (Травасол, Бакстер Канада, Міссісога, Онтаріо), Канада ) + 2% MVP при 120 мл/кг/добу; б) контроль + 9,6 г/кг/день амінокислот + 7,6 г/кг/день ліпідів (Інтраліпід 20%, Pharmacia, Peapack, Нью-Джерсі, США) при 120 мл/кг/день; для кінцевої концентрації (при 240 мл/кг/день) 1% MVP + 4,8 г/кг/день амінокислот + 3,8 г/кг/день ліпідів. Склад режиму TPN був отриманий з рекомендацій для досліджень на дорослих морських свинках (18).

Світло TPN (-): Той самий TPN захищений від зовнішнього світла.

Щоб оцінити, чи ефекти, що спостерігаються при MVP та TPN, пов’язані з пероксидами та/або вільними радикалами, інша група тварин отримує одне з наступних рішень:

С (контроль): 50 г/л декстрози + 4,5 г/л NaCl + 1 одиниця гепарину/мл.

H 2 O 2: контроль + 200 або 500 мкМ H 2 O 2 (Aldrich Chemical, Мілуокі, Вісконсин, США) (208 ± 15 та 500 ± 20 мкМ).

TBH: контроль + 50 мкМ TBH (Aldrich Chemical) (виміряно 47 ± 1).

Щоб виділити роль рибофлавіну та визначити, чи вплив полівітамінів був специфічним для MVP, іншим групам тварин вводили одну з таких схем:

C: те саме, що і вище

MVP + світло: як описано вище в протоколі 1.

MVP + світло без рибофлавіну: 1% MVP, приготовлений Sabex без рибофлавіну, незахищений від навколишнього світла та розведений у контрольному розчині.

MVI + світло: 1% (v/v) MVI (Aventis, Страсбург, Франція), незахищений від навколишнього світла та розведений у контрольному розчині; 5 мл розчину, відновленого з порошку, містить: вітамін А, 2300 ОД; вітамін D, 400 МО; α-токоферол, 7 МО; вітамін К, 200 мкг; аскорбат, 80 мг; тіамін, 1,2 мг; рибофлавін, 1,4 мг; піридоксин, 1,0 мг; пантотенат, 5 мг; фолат, 0,14 мг; ціанокобаламін, 1 мкг; нікотинамід, 17 мг; біотин, 20 мкг; і добавки BHA, BHT і манітолу, а також полісорбати як емульгатори.

CVI + світло: 1% (об/об) Cernevit (Baxter, Канада), незахищений від навколишнього світла та розведений у контрольному розчині; 5 мл розчину містить вітамін А, 3500 ОД; вітамін D, 220 ОД; α-токоферол, 11, 2 МО; аскорбат, 125 мг; тіамін, 3,51 мг; рибофлавін, 4, 14 мг; піридоксин, 4,53 мг; пантотенат, 17, 25 мг; фолат, 414 мкг; ціанокобаламін, 6 мкг; нікотинамід, 46 мг; біотин, 69 мкг; і глікокол, глікохолеву кислоту та соєвий лецитин.

Гістологія.

Після фарбування гематоксилін-еозином проводили гепатологічну гістологію, а ступінь тяжкості стеатозу оцінювали 0–4 (рис. 1) патологами (PB) та гепатологами (FA), які не знали про режим внутрішньовенного введення. Оцінка вказувала наступне: 0 = нормальна структура печінки; 1 = наявність видимих ​​жирових вакуолей в окремих ізольованих гепатоцитах; 2 = вогнищеві зміни жиру гетерогенного часточкового розподілу; 3 = дифузні зміни жиру з нежирними рідкісними зонами; 4 = дисперсна зміна жиру, без "знежирених" зон.

парентеральних

Печінкова гістологія (x 250), що ілюструє оцінки ступеня тяжкості стеатозу, зафіксовані від 0 до 4.

Повнорозмірне зображення

Аналітичні процедури.

Пероксиди вимірювали за допомогою ксиленолової помаранчевої методики (19), як описано вище. Цей хімічний тест, який вимірює H 2 O 2, а також органічні пероксиди (19, 20), підтверджується для розчинів TPN за допомогою ферментативного тесту (21). Середні рівні пероксиду для трьох зразків були MVI = 295 ± 8 мкМ; CVI = 358 ± 28 мкМ; MVP = 198 ± 14 мкМ; Фотозахищений MVP = 131 ± 10 мкМ; і MVP без рибофлавіну = 129 ± 3 мкМ. Ізопростан F2a вимірювали за допомогою комерційного набору імуноферментних аналізів (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Рівні тригліцеридів печінки вимірювали ферментативно за допомогою комерційних наборів (Roche Diagnostics, Laval, Квебек, Канада).

Статистичний аналіз.

Усі результати представлені як середнє значення ± SEM. Результати стеатозу аналізували тестом Манна-Уітні для непараметричних даних. Антропометричні характеристики тварин (табл. 1) та ізопростан F2a печінки порівнювали за допомогою ANOVA після перетворення (природний логарифм), щоб забезпечити гомосцедастичність, визначену за хі-квадратом Бартлетта. Рівень значущості був встановлений на стор

Вплив парентеральних полівітамінів (MVP), TPN (5% декстрози + 0,45% NaCl + амінокислоти + ліпіди + MVP) та світлового впливу (± світло) на (A) тяжкість стеатозу печінки (оцінка 0-4) та (B) ) печінковий ізопростан F2α. Полівітаміни та TPN були пов’язані зі стеатозом, ступінь вираженості якого зменшилась завдяки фотозахисту (- світло). Фотозахист значно знизив рівень ізопростану, який не відповідав ступеню тяжкості стеатозу, оскільки TPN індукував значно вищі рівні цього ейкозаноїдного маркера атаки вільних радикалів. Кожен стовпець представляє середнє значення ± SEM (кількість зразків). * p 2 (рис. 3). 2 Б).

Вплив інфузії H 2 O 2 та TBH на (A) ступінь тяжкості стеатозу та (B) печінковий ізопростан F2α. H 2 O 2 і TBH, що вводяться протягом ряду концентрацій, що виробляються в полівітамінах, не дають результатів стеатозу печінки, вищих за контрольні (C = 5% декстрози + 0,45% NaCl). H 2 O 2 викликав окисне навантаження, оскільки мав позитивний вплив на рівень ізопростану F2a. Кожен стовпець представляє середнє значення ± SEM (кількість зразків). * стор

Порівняно з контролем (C = 5% декстрози + 0,45% NaCl), фотоекспоновані (+ легкі) полівітамінні препарати (MVP, MVI, CVI) збільшували стеатоз печінки (оцінка 0–4). Роль рибофлавіну в впливі світла була перевірена за допомогою препарату без цього світлочутливого вітаміну (MVP без рибофлавіну). Кожен стовпець представляє середнє значення ± SEM (кількість зразків). * p C: