Резюме

Включення циклопропену, отриманого з антитіла лізину, дозволяє специфічному, швидкому та ефективному зв'язуванню молекул, що містять тетразин, генерувати кон'юговані ліки антитіл.

Анотація

Вступ

Кон'югати антитіло-лікарські засоби (АЦП) поєднують в собі селективність біотерапевтичних засобів та ефективність малих цитотоксичних молекул. Більшість АЦП стверджують, що зменшують побічні ефекти традиційної хіміотерапії, орієнтуючись на препарати, що впливають на полімеризацію ДНК або мікротрубочок ракових клітин 1. АЦП першого покоління, затверджені Управлінням з контролю за продуктами та ліками (FDA), засновані на модифікації лізинів та цистеїнів, що утворює суміші модифікованих молекул у різних положеннях із зниженими фармакокінетичними властивостями 2. Навпаки, специфічна кон’югація ліків до антитіл може генерувати сполуки з кращими терапевтичними показниками 3, 4. Намагаючись вирішити проблему виробництва однорідних АЦП, повідомляється про кілька селективних хімічних та ферментативних модифікацій 1, 5. Однак сучасні методи можуть націлювати лише певне положення на антитіло, страждати від низької експресії білка, забезпечувати лінкери з низькою стабільністю або залежати від повільних реакцій та низького виходу.

Включення неканонічних амінокислот (ncAA) за рахунок розширення генетичного коду дозволяє конкретну установку безлічі реактивних біоортогональних груп у білки, потенційно долаючи обмеження інших методів, що використовуються для отримання АЦП. Кодування ncAA у відповідь на цільовий (стоп) кодон базується на парах аміноацил-тРНК-синтетаза/тРНК, які є ортогональними до ендогенних пар, що включають 6 канонічних амінокислот. Кілька NcAA були включені в антитіла для генерування ADC. Однак різні зобов'язання страждають більше від застосування в кон'югації терапевтичних препаратів. p-ацетилфенілаланін (pAcF) 7, 8 не є повністю біоортогональним, він вимагає низького рН (4,5) і тривалого часу реакції (> 60 год), тоді як азиди, такі як p-азидофенілаланін (pAzF) 7, 9, 10, p- азидометилфенілаланін (реверс) 11 і похідне азиду лізину (AzK) 12, 13 можуть бути відновлені в клітині 14, а мідь, що використовується для каталізації активності Гюйсгена, може спричинити окислювальну шкоду 15 .

Хоча на основі транспорту альтернативні ncAAs-циклооктен (TCO), циклооктин (SCO) та біцикло [6.1.0] нонен (BCN) нещодавно були кодовані в антитілі для цілей біовізуалізації, експресійна система зазнає дуже низьких урожаїв (0,5 мг/л) 16. З іншого боку, циклооктини та циклооктини - це великі та гідрофобні ручки, які можуть збільшити сприйнятливість АЦП до корисних навантажень - АГЦ-агрегати традиційно гідрофобні, а фізико-хімічні властивості ковбасної машини продемонстрували високий фармакокінетичний та терапевтичний індекс впливу 17. На противагу цьому, 1,3-заміщені циклопропени - це невеликі реакційноздатні групи, які повинні спричинити мінімальні зміни в структурі білка та фізико-хімічних властивостях 18. Циклопропени вибірково і швидко реагують з тетразинами за допомогою циклоприєднання Дільса-Альдера із зворотним електронним попитом 19. У цьому протоколі ми використовуємо похідне лізину (CypK, малюнок 1b) метилциклопропен, на який менше впливає стерична перешкода, ніж більші відфільтровані ненасичені кільця і ​​має константу швидкості реакції порядку 1-30 М -1 с -1 у водному середовищі 18, 20 .

Нещодавно він повідомив нам, як включити CypK в антитіла для генерування АЦП, реагуючи на цей біоортогональний мінімальний вал з молекулами, що містять тетразин 21. Тут ми описуємо процедуру підготовки АЦП більш докладно з акцентом на більш складних кроках. Включення CypK спрямоване на пару піролізил-тРНК-синтетази (PylRS)/tRNACUA (PylT) у відповідь на бурштиновий кодон, що вводиться у важкий ланцюг антитіла (HC) 22. Тут ми використовуємо дві плазміди для транзиторної трансфекції (рис. 1а), що кодує важкий ланцюг антитіла, а інший, що кодує легкий ланцюг (LC), обидва містять касету PylRS/PylT. З іншого боку, стабільна клітинна лінія, яка дозволяє отримати більш високий вихід антитіла, може бути отримана за допомогою більш трудомісткої процедури. .

Вищезазначені експресійні системи можуть продукувати терапевтичний анти-HER2 імуноглобулін 1 (IgG1) трастузумаб з CypK на рівнях, подібних до антитіл дикого типу. Ми вибрали першу позицію домену CH1 важкої ланцюга для кодування ncAA (HC-118TAG). Це найбільш часто модифікований сайт в АЦП 23 і відомий як HC-118 (перелік ЄС), але також відомий як HC-121 (положення послідовності) та HC-114 (перелік Кабата) 24. Оскільки це положення зберігається протягом IgG1, ці експресійні системи повинні бути чутливими до більшості терапевтичних антитіл.

Ми показали, що трастузумаб (CypK) 2 можна легко очистити від білка А з подальшою швидкою білковою рідинною хроматографією на колонці з гідрофобною взаємодією (HIC-FPLC). Згодом антитіло є ковалентним протягом 3 год до інгібітора полімеризації мікротрубочок монометил ауристатину Е (MMAE), який використовується у схваленому FDA Adcetris ADC. Тут ми використовуємо похідне бензилу тетразин MMAE (тетразин-vcMMAE) з лінкером, що включає глутаратний розпірний елемент та валін-цитрулінпротеазний лабільний компонент, за яким слідує самоспалювальна одиниця р-амінобензилалкоголю; Цей лінкер розщеплюється катепсином В в лізосомі при інтерналізації ADC, що призводить до вивільнення токсину 25, не залишаючи слідів. Щоб продемонструвати широту реакції, антитіло також зв’язане з фторофором тетраметилродаміном (TAMRA). Ми пояснюємо, як перевірити ідентичність кон'югату за допомогою рідинної хроматографії у поєднанні з мас-спектрометрією (LC-MS) та обчислити співвідношення лікарський засіб і антитіло (DAR) за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з колоною гідрофобної взаємодії (HIC-HPLC) .

В рамках характеристики характеристик антитіл ми описуємо, як перевірити стабільність суглобів дигідропіридазину в сироватці крові людини. Цей параметр легше оцінюється в трастузумаб-ТАМРА, оскільки його можна кількісно визначити за допомогою простого ІФА, а інтерпретація результатів не ускладнюється лабільним компонентом протеази трастузумабу (ММАЕ) 2. Нарешті, селективність та ефективність трастузумабу (MMAE) 2 оцінюється шляхом порівняння цитоксичності ADC у клітинних лініях, що виражають різні рівні HER2. Цей аналіз також забезпечує функціональний тест на стійкість ADC, коли імунокон'югат проводять після інкубації в сироватці людини.

Протокол

1. продукують і характеризують антитіло

4. оцінити цитотоксичність АЦП

Примітка: Цей протокол базується на раніше повідомлених випробуваннях 23, 26 з деякими змінами.

Репрезентативні результати

Розкрита перехідна система вираження (рис. 1а) виробляє 22 ± 2 мг трастузумабу (CypK) 2 на літр живильного середовища, що представляє 2/3 антитіла дикого типу, виробленого в тих самих умовах (Рисунок 1С). Стабільна клітинна лінія може збільшити цей вихід до 2 мг/л ± 31 21 .

Трастузумаб (CypK) 2 можна кон'югувати з тетразином-vcMMAE, що дає майже гомогенний трастузумаб (MMAE) від 2 до 3 год при 25 ° C (рис.2)). Висока гідрофобність цього цитотоксину вимагає додавання 10% ацетонітрилу, коли використовується 5 або більше молярних еквівалентів токсину на CypK. З іншого боку, циклоприєднання також закінчується протягом 20 годин двома еквівалентами тетразину-vcMMAE без ацетонітрилу (Рисунок 2C). Трастузумаб (CypK) 2 реагує з тетразином-ТАМРА протягом 2 годин при 25 ° C, а 3-6 годин потрібно при зниженні температури до 4 ° C (Рисунок 3C).

Прогнозований DAR для трастузумабу (MMAE) 2, виміряний за допомогою ВЕРХ-HIC, становить 1,9 (Рисунок 2b). Пік, спочатку спостеріганий на хроматограмі через 8,0 хв, являє собою некон'юговане антитіло (DAR 0) і повинен був повністю зникнути, коли реакція завершиться. Вид з DAR 1 елююється 9,1 9,6 хв і повинен мати площу 90%. Поворот рухливості та флуоресценції в гелях SDS-PAGE підтверджує включення TAMRA (малюнок 3b), а ідентичність імунокон'югатів перевіряють за допомогою LC-MS (рис. 2г-і y Рисунок 3d).

Інкубація трастузумабу (TAMRA) 2 протягом 5 днів у сироватці крові людини та подальший аналіз методом ІФА підтверджує, що навантаження залишається зв’язаною з антитілом (рис. 4b). За результатами аналізу цитотоксичності, трастузумаб (MMAE) 2 демонструє високу ефективність у ракових клітинах молочної залози SK-BR-3 (з високим HER2) із середньою максимальною ефективною концентрацією (EC50) 55 ± 22:00 (рис. 4 d). Трастузумаб (MMAE) 2 зберігає цитотоксичність після 5 днів інкубації в сироватці людини (рис. 4 c). На відміну від цього, при аналізі АЦП в MCF-7 (низький рівень HER2) EC50 є в 200 разів нижчим (Рисунок 4 d). Антитіла дикого типу, трастузумаб (CypK) 2 і тетразин-vcMMAE виявляють надзвичайно низьку токсичність (4e та 4 малюнки d), тоді як MMAE демонструє високу неселективну цитотоксичність в обох клітинних лініях (рис. 4е).

генетичне

Рисунок 1: Перехідна система вираження. ДО. області плазмід, що використовуються для транзиторної трансфекції в клітинах HEK293. CMV: промотор цитомегаловірусу, WPRE: посттранскрипційний регулюючий елемент вірусу гепатиту бабака, PylT: піролізил тРНК, U6: специфічний промотор, PylRS: пірролізил тРНК синтетаза,> та ε - [((2-метилциклопроп-2-ен- 1- іл) метокси) карбоніл] -L-лізин (CypK). C. Експресійні врожаї дикого типу трастузумабу (WT) та трастузумабу (CypK) 2, виміряні у вестерн-блотті після очищення білка. Смужки помилок представляють стандартне відхилення біологічних триплікатів. Ця цифра була змінена з дозволу Oller-Salvia et al. 2018 рік 21. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.


Рисунок 2: Кон'югація трастузумабу (CypK) 2 з тетразином-vcMMAE. ДО. Електронні зворотні вимоги вимагають циклоприєднання Дільса-Альдера між залишком CypK в антитілі та похідним тетразину MMAE. Групи реакцій виділені червоним кольором, p-амінобензилалкоголь представлений зеленим кольором, а дипептид валін-цитрулін синім кольором. B. ВЕРХ-HIC-хроматограми, що показують хід кон'югації антитіл. C. ступінь конверсії щодо максимального значення DAR 1,9 при різних концентраціях реагенту. ОФ. Деконволюційні мас-спектри повнорозмірних антитіл до та після кон'югації. Трастузумаб (CypK) 2 отримували за допомогою стабільної клітинної лінії. Ця цифра була змінена з дозволу Oller-Salvia et al. 2018 рік 21. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.


Рисунок 3: Кон'югація трастузумабу (CypK) 2 з тетразином-TAMRA. ДО. Електронні зворотні вимоги до циклоприєднання Дільса-Альдера між залишком CypK в антитілі та похідним тетразину TAMRA. B. Гелі SDS-PAGE, що демонструють зміну рухливості та флуоресценцію гелю, що походять від кон'югації TAMRA. C. словесна кінетика при двох різних температурах. D. Деконволюційний мас-спектр трастузумабу (TAMRA) 2. Трастузумаб (CypK) 2 отримували за допомогою стабільної клітинної лінії. Ця цифра була змінена з дозволу Oller-Salvia et al. 2018 рік 21. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.


Малюнок 4: Сироваткова стабільність та цитотоксичність кон’югатів трастузумабу. ДО. креслення, що висвітлюють бажані характеристики в інтегрованому АЦП. B. стабільність трастузумабу (TAMRA) 2 у сироватці крові людини, виміряну методом ІФА. C. аналіз життєздатності клітин за допомогою трастузумабу (MMAE) 2 через 5 днів у сироватці людини (+ сироватка, чорна). Контрольний зразок інкубували в PBS замість сироватки (-сироватка, червона) включали в її аналіз. D. аналіз життєздатності клітин зі свіжорозведеними зразками антитіл. І. аналіз життєздатності клітин зі свіжорозведеними похідними ММАЕ. Смужки помилок представляють стандартну похибку середнього значення 3 незалежних експериментів. Ця цифра була змінена з дозволу Oller-Salvia et al. 2018 рік 21. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Обговорення

Процедура перехідної експресії для отримання трастузумабу (CypK) 2, описана в цьому протоколі, проста і забезпечує високу модульність. Отримані врожаї відповідають очікуваним в академічному середовищі 27, і стабільні клітинні лінії можуть бути створені для подальшого підвищення продуктивності 21. Під час експресії концентрація CypK менше 5 мМ може призвести до меншого вмісту ncAA, а більша кількість може вплинути на ріст клітин та зменшити вироблення антитіл. CypK як вільна амінокислота має низьку розчинність у воді, тому його спочатку слід розчинити в 100 мМ 0,1 М NaOH, а потім додати до живильного середовища. Після розведення CypK у середовищі та перед додаванням у клітини важливо нейтралізувати середовище соляною кислотою та фільтр для стерилізації. Згодом використання реагентів для трансфекції, зазначених у цьому Протоколі, та дотримання рекомендованих виробником часу інкубації є важливим для високопродуктивної експресії. Для отримання додаткової інформації про транзиторну експресію людських антитіл читач посилається на інші опубліковані протоколи 31, 32 .

Описана технологія ADC дозволяє ефективно та специфічно включати похідне циклопропену лізину в IgG1. Після легкого очищення антитіла можуть швидко кон'югуватися з молекулами, що містять тетразин, отримуючи однорідні продукти. Через малі розміри та високу реакційну здатність мінімального циклопропену на рукоятці, цей метод повинен дозволяти кон’югацію стерично утруднених зарядів. Отримані імунокон'югати стабільні в сироватці крові і є дуже потужними та селективними. Взагалі, CypK дозволяє швидко, специфічно і стабільно поєднувати антиортитіла та інші кон'юговані білки для використання в терапії або діагностиці.