S KoA. a, R-COOH + ATP + CoA R C
Молекулярно-генетичне та клінічне дослідження класичної галактоземії, дефіциту галактокінази та дефіциту біотинідази Докторська дисертація Міланкович Докторська школа молекулярної медицини Університету Ілони Земмельвейс Підготовлено: Університет Земмельвейса, II Департамент педіатрії Керівник програми: д-р Андраш Фалус, професор, доктор Угорської академії наук. Наукові керівники: д-р Вероніка Карцагі, завідувач кафедри, д-р д-р Аґнес Шулер, головний лікар, к.е. Екзаменаційна комісія: Голова: д-р Ендре Черхаті, професор університету, доктор Угорської академії наук Члени: д-р Чаба Шалай, старший науковий співробітник, доктор Угорської академії наук д-р Естер Карг, науковий співробітник, к.т.н. Офіційні судді: д-р Ева Олах, професор університету, доктор Угорської академії наук д-р Каролі Рач, викладач університету, лікар Угорської академії наук Будапешт, 2010 р.
Зміст Зміст Список скорочень 5 1. Вступ 6 2. Огляд літератури 7 2.1. Вроджені метаболічні захворювання 7 2.1.1. Патогенез та клініка вроджених метаболічних захворювань 7 2.1.2. Основні групи вроджених метаболічних захворювань 9 2.1.3. Терапія вроджених метаболічних захворювань 12 2.2. Галактоземія 13 2.2.1. Обмін галактози 13 2.2.2. Класична галактоземія 14 2.2.3. Спадщина класичної галактоземії 15 2.2.4. Дефіцит галактокінази 17 2.2.5. Спадкування дефіциту галактокінази 17 2.2.6. Дефіцит UDP-галактози-4-епімерази 19 2.2.7. Спадщина дефіциту UDP-галактози-4-епімерази 20 2.2.8. Терапія та догляд за галактоземією 21 2.3. Дефіцит біотинідази 23 2.3.1. Цикл біотину 23 2.3.2. Дефіцит біотинідази 24 2.3.3. Спадкування дефіциту біотинідази 25 2.3.4. Терапія та догляд за дефіцитом біотинідази 27 2.4. Скринінг маси новонароджених 28 2.4.1. Початок скринінгу маси новонароджених 28 2.4.2. Масовий скринінг новонароджених в Угорщині 29 2.4.3. Скринінг маси новонароджених на галактоземію 30 2.4.4. Масовий скринінг дефіциту біотинідази у новонароджених 31 2.5. Значення молекулярно-генетичних досліджень 33 3. Завдання 35 4. Методи 37 4.1. Вивчені пацієнти 37 4.1.1. Класична галактоземія 37 4.1.2. Дефіцит галактокінази 37 4.1.3. Додаткові пацієнти пройшли обстеження на високий рівень галактози 38 2
Список скорочень Список скорочень A: аденин BTD: біотинідаза C: цитозин D1: Duarte-1, варіант Лос-Анджелеса D2: Duarte-2, варіант Duarte EDTA: етилендіамінтетраоцтова кислота ІФА: імуноферментний аналіз G *: класичний галактозний алель G: гуанін G-1-P: глюкоза-1-фосфат G-6-P: глюкоза-6-фосфат G-6-PDH: глюкоза-6-фосфатдегідрогеназа GALE: уридилдифосфат галактоза-4-епімераза GALK: галактокіназа GALT: галактоза-1-фосфат-уридилтрансфераза IVS: варіація послідовності інтронів LTFU: довготривале спостереження довгострокове спостереження MIM: Менделівське спадкування у людини N: нормальний алель NADP: нікотинамід аденін динуклеотид фосфін невизначений OD: оптична густина PABA: пара -амінобензойна кислота ПЛР: полімеразна ланцюгова реакція 6-PGA: 6-фосфоглюконат 6-PGD: 6-фосфоглюконатдегідрогеназа PKU: фенілкетонурія R-5-P: рибулоза-5-фосфат RFLP: поліморфізм довжини фрагмента рестрикції STFU: короткочасний короткочасне спостереження Т: тимін UDP-галактоза: уридил-дифосфат-галактоза UDP-глюкоза: урі дилдіфосфат глюкоза ВООЗ: Всесвітня організація охорони здоров'я 5
Огляд літератури Внутрішня частота класичної галактоземії становить 1: 46 000, що відповідає захворюваності серед кавказького населення [Schweitzer-Krantz, 2003; Бош та ін., 2005]. 2.2.3. Спадщина класичної галактоземії Класична галактоземія - це аутосомно-рецесивно успадковане моногенне захворювання. Ген GALT, що кодує фермент галактоза-1-фосфат-уридилтрансферази, розташований на короткому плечі хромосоми 9 (9p13), має довжину приблизно 4,3 кб і містить 11 екзонів (малюнок 2) (Leslie et al., 1992). У літературі описано понад 180 мутацій, що викликають класичну галактоземію [Тайфілд та Кармайкл]. Три з цих місенс-мутацій (p.q188r, p.k285n та p.n314d) надзвичайно поширені серед кавказького населення. Загальна частота алелів трьох мутацій у пацієнтів у деяких країнах сягає 80–90% [Tyfield, 2000]. Рисунок 2 A: Локалізація гена GALT в хромосомі 9 (джерело: www.genecards.org) B: Структура гена GALT (джерело: www.dsi.univ-paris5.fr/genatlas) C: Структура гена GALT cdns, локалізація мутацій p.q188r, p.k285n та p.n314d на cdns Найбільш поширеною мутацією у пацієнтів із класичною галактоземією є мутація p.q188r (c.563a> g), яка присутня в екзоні 6, 188 викликає обмін глутаміну/аргініну при кодоні (рис. 2). Частота алелей мутації в Західній Європі становила 15
Огляд літератури 2.2.7. Спадщина дефіциту UDP-галактози-4-епімерази Дефіцит UDP-галактози-4-епімерази також успадковується аутосомно-рецесивно. Ген GALE, що кодує фермент, розташований на короткому плечі хромосоми 1 (1p36-p35) [Benn et al., 1979; Lin et al., 1979; Daude et al., 1995], має довжину приблизно 4 кб і містить 11 екзонів (малюнок 4). Кодон ATG, що кодує вихідний метіонін ферменту, знаходиться в екзоні 2 [Maceratesi et al., 1998]. На сьогоднішній день в літературі описано приблизно 20 різних мутацій, які викликають дефіцит UDP-галактозо-4-епімерази [Wohlers et al., 1999; Хендерсон та ін., 2001; Парк та ін., 2005]. Рисунок 4 A: Локалізація гена GALE в хромосомі 1 (джерело: www.genecards.org) B: Структура гена GALE (джерело: www.dsi.univ-paris5.fr/genatlas) C: Структура гена GALE cdns 20
Огляд літератури 2.3. Дефіцит біотинідази 2.3.1. Цикл біотину Біотин - це водорозчинний, необхідний вітамін B-комплексу (вітамін H), який діє як кофактор чотирьох ферментів карбоксилази в організмі людини [Thoma, 1954; Піспа, 1965]. При нормальному харчуванні в наш організм потрапляє лише мінімальна кількість біотину. Хоча певні продукти (печінка, нирки, борошно, соєве борошно, яєчний жовток, дріжджі) містять більшу кількість вітаміну Н, більш високе споживання цих продуктів також не покриває потреб людини. Для того, щоб біотин міг бути присутнім у правильній концентрації в нашому організмі, необхідний цикл біотину, що дозволяє використовувати молекулу кілька разів (рис. 5). Малюнок 5. Цикл біотину Біотин потрапляє в наш організм через їжу у зв’язаній з білками або вільній формі. Карбоксильна група молекули ковалентно пов’язана амідним зв’язком з ферментом голокарбоксилазою синтетазою (EC 6.3.4.10.)
Огляд літератури 2.3.4. Терапія та догляд за дефіцитом біотинідази Дефіцит біотинідази лікується заміною біотину. Рання діагностика (див. Розділ 4.5) та раннє початок лікування надзвичайно важливі, щоб уникнути незворотних порушень, таких як втрата слуху, порушення зору або розумова відсталість. Фармакологічна доза становить 5-20 мг біотину на добу, залежно від тяжкості симптомів. Терапія часто дуже ефектно усуває оборотні симптоми захворювання протягом декількох тижнів [Mock et al., 1985; Swick and Kien, 1985] (рис. 7). Малюнок 7. Вплив терапії біотином у дітей з дефіцитом біотинідази A: Через 15 днів заміщення біотином важкі шкірні симптоми значно покращились (джерело: Mock et al., 1985) B: після шести місяців терапії біотином симптоми алопеції повністю зникли (джерело: Swick та Кіен, 1985) 27
Методологія огляду літератури [Knappe et al., 1963], Heard et al. отримав подальший розвиток у метод масового скринінгу, що дозволяє діагностувати дефіцит біотинідази у віці кількох днів [Heard et al., 1984]. Масовий скринінг дефіциту біотинідази в Угорщині розпочався в 1989 році за ініціативою тодішнього генерального директора Національного інституту здоров’я немовлят та дітей, професора д-ра Дезшу Шулера. Міністерство охорони здоров’я зробило масовий скринінг новонароджених хворобою обов’язковим на національному рівні в обох скринінгових центрах [Havass, 1991]. Скринінг на дефіцит біотинідази поділяється подібно до галактоземії. З 51 держави-члена в США 47 мають обов'язковий обов'язковий скринінг новонароджених [Therrell and Adams, 2007]. У Європі скринінг запроваджено у шести країнах: Швеції, Німеччині, Швейцарії, Ліхтенштейні, Австрії та Угорщині. Ще чотири країни: Іспанія, Бельгія, Італія та Туреччина знаходяться або на експериментальній фазі встановлення скринінгу, або проводять скринінг лише певних діапазонів (Рисунок 10.B) [Loeber, 2007]. Малюнок 10. Скринінг на галактоземію (А) та дефіцит біотинідази (В) у Європі (на основі статистичних даних 2004 р .; Loeber, 2007) 32
Методи вимірювання [Beutler and Baluda, 1966]. Фермент GALT у зразку крові ініціює ферментативну послідовність у реакційній суміші, в кінці якої НАДФ відновлюється. GALT Gal-1-P + UDPG G-1-P + UDP-Gal фосфоглюкомутаза G-1-P G-6-P G-6-PDH G-6-P + NADP 6-PGA + NADPH 6-PGD 6- PGA + NADP R-5-P + NADPH Рівень утвореного NADPH пропорційний активності ферменту GALT. Під час оцінки флуоресценцію виявляли за допомогою УФ-лампи. 4.6. Диференціальна діагностика при галактоземії Під час масового скринінгу при всіх формах галактоземії виявляються високі рівні галактози/загальної галактози. Вимірювання активності ферментів доступне в Угорщині лише у випадку з ферментом GALT, тому точна диференціальна діагностика галактоземії в Угорщині може бути виконана молекулярно-генетичними методами (рис. 13). Малюнок 13. Блок-схема диференціальної діагностики галактоземії 43
Методи З дисків, потім проводились подальші хімічні реакції до остаточної кольорової реакції. Замість пробірок використовували мікротитрувальну пластинку, а оптичну щільність вимірювали на ІФА-пристрої (рис. 14.B) [Schuler et al., 2007]. Малюнок 14. Методи скринінгу на дефіцит біотинідази A: Ензиматичний метод кількісного аналізу між 1989 і 2004 рр. B: Метод кількісного аналізу ферментів з 2004 р. Комп’ютер, підключений до зчитувача, негайно перетворив виміряну оптичну щільність у процентну активність ферменту, даючи кількісний результат. При розробці методології було важливо, щоб оптична щільність зчитування при 545 нм була прямо пропорційною ферментній активності сироваткової біотинідази. Щоб перевірити це, досліджували оптичну щільність стандартних зразків крові з відомою та зростаючою активністю ферментів. Побудова графіку виміряного OD як функції процентної активності ферменту дало лінійну лінію, яка підтвердила ефективність методу (рис. 15). Малюнок 15. Активність ферменту біотинідази як функція оптичної щільності 45
Методи Використовували Bioline Immomix виробництва Roche. Виявлення проводили на 2% агарозному гелі методом гель-електрофорезу. 4.15. Статистичні методи Для порівняння частоти клінічних симптомів використовували точний тест Фішера. У популяційних генетичних дослідженнях тест χ 2 використовували для порівняння частоти мутацій у різних популяціях. Розрахунки проводились за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (GraphPad Software, США). 54
Результати Кількість пацієнтів Алель мутації 1 Алель мутації 2 Вік * (рік) Немає неонатальних симптомів Пізні симптоми 32 п.к. 188р п. 146 д. 25 Жінки Д - 25% 33 п. Р. 188 р. П. 146 д. 16 Чоловіки НБ 25% 34 п. К. 285 н. 4 Жінки N 25% 35 p.k285n nd 4 Чоловіки N 25% 36 p.k285n p.n314d p.l218l 37 p.q188r p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 38 p.q188r p.n314d p.e340k 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 39 p.k285n p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 40 p.k285n p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 41 p.p325l p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 42 p.m142k p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 43 n p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 44 n p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 45 n p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 46-й р. N314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A GALT # активність 60 Чоловіки й - 50% 19 Жінки D - 25% 14 Чоловіки D - 25% 41 Чоловіки й - 25% - Чоловіки E d 25% 4 Чоловіки N 25% 3 Жінки D 25% 4 Жінки D 25% 3 Жінки N 25% 3 Жінки N 25% 2 Жінки D 25% 61
Результати У групі пацієнтів в інтроні 7 були виявлені промотор (c.-179a> g) та поліморфізм інтрону (IVS8nt-40C> T [c.1171-40c> t]). Малюнок 20. Гомозиготне секвенування нової мутації, виявленої в мутації p.l263p гена GALK1 (c.2430t> c), заміщення амінокислот лейцином> проліном Крім пацієнтів, ми провели молекулярно-генетичне тестування на дванадцяти прямих членах сім'ї в одній сім'ї, які були носіями мутації p.p28t. Цікаво, що ця сім’я несла лос-анджелеський варіант гена GALT на материнській гілці. Всього в сім’ї було сім носіїв мутації p.n314d: p.l1818l, включаючи вихователя (III./1.) З дефіцитом галактокінази та матері (II./3.) Та діда по матері (с. 28tl) з мутацією p.p28t. I./3.) (Малюнок 21). Відповідно, член родини був гомозиготним за варіантом Лос-Анджелеса (II./7). Рисунок 21. Генеалогічне дерево пацієнта з дефіцитом галактокінази; сім'я несе мутацію p.p28t в гені GALK1 та варіанті гена GALT в Лос-Анджелесі (D1) 64
Результати Рисунок 22. Гетерозиготна послідовність п'яти нових мутацій, виявлених у гені BTD: мутація p.e46x (c.136g> t), глутамінова кислота> стоп-заміщення кодону B: мутація p.t152p (c.454a> c), амінокислота треонін> заміна C: мутація p.r157c (c.469c> t), аргінін> заміна амінокислоти цистеїну D: мутація p.n195s (c.584a> g), аспарагін> заміна амінокислоти серину E: c мутація делеції delc c.406 щодо мутацій, що викликають знижену активність ферментів і, отже, захворювання, крім того, ми також виявили дві безшумні мутації: мутацію p.l215l (c.645c> t) в одному випадку, а заміщення амінокислоти p.c471c (c.1413t> c) мутацію можна було виявити в трьох незалежних сім'ях, загалом для шести особин. Крім того, у носія виявлено ще одну мутаційну мутацію, що спричиняє важку форму дефіциту біотинідази (29-01): p.t532m (c.1595c> t). На додаток до пацієнтів, молекулярно-генетичному аналізу піддано в цілому 132 безпосередніх членів сім'ї в тридцяти шести сім'ях, 95 з яких були визнані носіями однієї з мутацій з дефіцитом біотинідази. 68
Результати 5.4.2. Генотипи та клінічні симптоми хворих з дефіцитом біотинідази Важка форма дефіциту біотинідази в регіоні Західної Угорщини (відносна активність ферменту BTD T 0,07 1% 17 I Sz 38-01 п.а82d nd 0,28 4% 19 - E 39-01 с. v199m p.r211c 0,50 7% 18 I, Sz E 56-01 c.406delc p.a171t p.d444h 0,36 5% 0,5 I Пацієнти Мутація Мутація Біотаксична Біотинідаза Вік Неонатальний Пізній 1 алель 2. алель нмоль/хв/мл дія% ( рік) * симптоми симптоми 04-01 p.q456h p.d444h 1,63 23% 5 Sz E, Sz 09-01 p.q456h p.d444h 1,49 21% 4 Sz E, Sz 09-02 p.q456h p.d444h 1,35 19 % 10 Sz E, Sz 13-01 p.q456h p.d444h 1,56 22% 15 I, Sz - 13-02 p. Q456h p.d444h 1,70 24% 12 - E, Sz, A 15-01 p.q456h p. d444h 1,49 21% 4 Sz Sz, H 69
Обговорення Серед пізніх симптомів галактоземії виникли проблеми з мовою (вербальна диспраксія). Глутамінова кислота в положенні 146 білка GALT характеризується високим ступенем консерватизму, при цьому глутамінова кислота в цьому положенні у більшості видів (рис. 24А). Приблизно приблизно 25% залишкової активності ферменту GALT, мабуть, обумовлена консервативними замінами амінокислот: амінокислота, кодована кодоном 146, перетворюється на аспарагінову кислоту замість глутамінової кислоти. Малюнок 24. Послідовність амінокислот та консерватизм білка GALT у різних видів, с. Локалізація мутацій E146D (A) та p.s297p (B) джерело: www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez Мутація p.s297p у положенні 297 білка GALT викликає зміну амінокислоти серин/пролін. Мутація була виявлена у пацієнтки, яка народилася за шість років до початку масового скринінгу новонароджених на галактоземію (табл. 8, пацієнт 27). Хоча пацієнтка виявляла всі симптоми класичної галактоземії у новонароджених (виражена жовтяниця, втрата апетиту, стійка втрата ваги, порушення рівня печінкових ферментів 78
Також обговорювали питання обміну крові у дитини), проте точний діагноз був поставлений лише у віці чотирьох місяців. Відтоді пацієнт сидів на дієті. Він показує всі симптоми космічних ускладнень при класичній галактоземії. У п’ять місяців вона помітила свою двосторонню катаракту, яку прооперували спочатку у віці двох, а потім ще чотири рази. Сьогодні він носить 10 окулярів з діоптрією на одне, а 10 на інше. Він бореться з важкими мовними проблемами (словесна диспраксія): він майже не говорить, його спонтанна мова незрозуміла, його артикуляція дуже помазана. Порушення функції моторної функції (жорсткий рух, безперервне тремтіння рук, посмикування). Його поведінка характеризується емоційною лабільністю, агресивними нападами, спалахами гніву та депресією. Пацієнт розумово відсталий (IQ = 52), повторює свої стереотипи, його здатність розпізнавати ситуацію та спостережливість неточна, слабка. У цього пацієнта під час молекулярно-генетичного тестування було виявлено змішаний гетерозиготний генотип p.q188r/p.s297p. Мутаційний аналіз та вимірювання активності ферментів на членах сім'ї підтвердили, що мутація p.s297p була в гетерозиготній формі.
Струшування обговорення тощо). Наші дані суттєво не відрізнялися від Wagoner et al. однак результати в Німеччині були значно нижчими (37%) (рис. 25). Малюнок 25. Частота довготривалих клінічних симптомів при важких формах класичної галактоземії зелений бар (A): власні дані; жовта колонка (B): дані Wagoner та ін., (1990); червона колонка (C): Schweitzer et al., (1993); число над стовпчиковою діаграмою - це частота (%) клінічного ознаки, що досліджується; чорне число в дужках - це кількість досліджених пацієнтів (n); число кольорів у дужках - це значення, отримане за допомогою точного тесту Фішера (p) порівняння наших власних даних з міжнародними даними; червоний колір: значна різниця (р 0,05) Серед пацієнтів із класичною галактоземією, які проходили лікування у Будапештському центрі метаболічної допомоги, найпоширенішим довготривалим клінічним симптомом є проблема мовлення (88%). Пізній розвиток мовлення, бідніший словниковий запас та проблеми артикуляції (вербальна диспраксія) є загальними [Webb et al., 2003]. Порівнюючи дані, описані на основі літератури, з нашими власними даними, різні мовленнєві розлади виявлялись значно частіше у пацієнтів у Західній Угорщині, ніж в інших країнах (рис. 25). 81