- предметів
- реферат
- вступ
- результат
- Клональний склад групи HSC через вік
- Функціональний зворот старих клонів HSC
- обговорення
- методи
- мишей
- Імунофенотиповий аналіз та сортування клітин
- Дослідження клональності старіння HSC
- Виведення клітин iPS
- Генерація та характеристика клонів конкретних химерних мишей
- статистика
- Наявність даних
- Детальніше
- Додаткова інформація
- Файли PDF
- Додаткова інформація
- Файл огляду
- Файли Excel
- Додаткова інформація 1
- Коментарі
предметів
- старіння
- кровотворення
- Кровотворні стовбурові клітини
реферат
Старіння асоціюється зі значними змінами в соматичних/дорослих стовбурових клітинах, і лікування для протидії цим може мати значну користь для здоров'я. У крові старіння гемопоетичних стовбурових клітин (HSC) пов'язане з кількома функціональними недоліками. Однак, крім нещодавнього виявлення, що окремі ГСК можуть бути встановлені по-різному, ніж молодий вік, ГСК також можуть старіти асинхронно. Тому оцінка перспектив омолодження HSC вимагає підходу до тих HSC, на які функціонально впливає вік. Тут ми поєднуємо генетичні штрих-коди старих мишей HSC з утворенням індукованих плюрипотентних стовбурових клітин (iPS). Це дозволяє нам конкретно орієнтуватися на старі HSC, які мають позначені похилі лінії, що є ознакою старіння HSC. Функціональні та молекулярні оцінки показують, що кровотворення з цих клонів iPS не відрізняється від гемопоезу, пов’язаного з молодими мишами. Таким чином, наші дані забезпечують пряму підтримку ідеї про те, що кілька ключових функціональних атрибутів старіння HSC можна змінити.
Старіння асоціюється з глибокою схильністю до ряду захворювань, які включають більшу поширеність анемії, лейкемії та порушення імунітету в крові 1. Хоча вікові захворювання можуть здаватися наслідками змін, які порушують або змінюють функцію зрілих ефекторних клітин, їх важче узгодити з такими органами, як кров, які покладаються на недовговічні ефекторні клітини, які потребують постійного поповнення 1. 2, 3. Швидше, зібрані дані дозволяють припустити, що виробництво de novo підкласів клітин гемопоетичних клітин змінюється з віком 4, 5, 6, 7, подібно до більш вузьких часових вікон у початковому розвитку 8. Ці висновки також значною мірою кинули виклик класично визначеним критеріям гемопоетичних стовбурових клітин (HSC) як однорідної популяції клітин з диференційованою здатністю для всіх гемопоетичних ліній. Швидше, диференціальну ємність HSC можна більш доречно визначити як безперервний багатокамерний гемопоетичний вихід, який, проте, не обов'язково передбачає вироблення всіх типів клітин крові в усі моменти часу.
Хоча багато змін у старінні дорослих пояснюються змінами функції 1 HSC, окремі компоненти групи HSC можуть виявити суттєві зміни функції 4, 9, 10. На додаток до того, що різні HSC встановлюються по-різному 5, 6, 11, що може поступово змінювати склад групи HSC з віком 5, 6 років, інші механізми, що ведуть до сегментарних змін у групі HSC, включаючи вплив на навколишнє середовище, нерівномірне розмноження та відновлення Можливі також мутації ДНК в окремих клітинах. Таким чином, неоднорідність окремих клітин враховується не лише шляхом оцінки хронологічно старих популяцій клітин.
Механізми, що обумовлюють старіння як на рівні організму, так і на рівні клітин, привернули значну увагу, оскільки вони є головними об'єктами втручання. Наприклад, у різних модельних організмах повідомляється про тривалий стан здоров’я та довголіття через обмеження калорій та/або маніпуляції з осями IGF1 та mTOR 3. Крім того, підвищена функція старих клітин була запропонована через "молоді" системні фактори12. Чи насправді такі підходи відображають омолодження на клітинному рівні чи, навпаки, стимулюють менш уражені віком клітини, в основному незрозуміло. Це занепокоєння також стосується попередніх досліджень, які наближаються до перспектив зворотного старіння клітин шляхом перепрограмування соматичних клітин 13, 14, 15, які зазвичай не розрізняють функціонально та хронологічно старі клітини. З цією метою необхідно достовірно визначити функцію конкретної батьківської донорської клітини, що використовується для перепрограмування, що вимагає оцінки на рівні клональної/індивідуальної клітини.
Тут ми вирішуємо ці проблеми за допомогою генетичного штрихового кодування молодих та старих HSC, що дозволяє оцінити їх регенеративну здатність після трансплантації на клональному рівні. Це дозволяє нам виявити, що старіння пов'язане зі зменшенням лімфоїдного потенціалу клонів HSC та збільшенням мієлоїдного потенціалу клонів. Ми виробляємо індуковані плюрипотентні стовбурові (iPS) лінії з функціонально визначених старих клонів HSC, які ми додатково оцінюємо на їх здатність утворювати кров після редиференціації до HSC шляхом доповнення бластоцисти/морули. Наші експерименти показують, що всі випробувані клони iPS, включаючи ті, які спочатку були повністю позбавлені Т- та/або В-клітинного потенціалу, функціонують аналогічно молодим стаціонарним HSC (химерам 1 °), хоча вони змушені регенерувати лімфомієлоїдний кровотворення вторинні трансплантації. Ця функція знову збігається з властивостями транскрипції, якими користуються молоді, а не старі HSC. Тому ми надаємо пряму підтримку ідеї про те, що декілька функціональних аспектів старіння HSC можна змінити.
результат
Клональний склад групи HSC через вік
На етапах 1 і 2 молодих та старших HSC ізолювали, штрихкодували і конкурентно пересаджували у смертельно опромінених молодих господарів. Після визначення та оцінки довгострокового кровотворення, що сприяє кодуванню лінійних клітин (етап 3а), периферичні клітини В, Т та мієлоїдні клітини, а також попередники еритроїдних клітин ВМ були виділені та піддані поглибленому секвенуванню для розриву їх основних штрих-кодів ( крок 3b).). У той же час незрілі клітини ВМ були виділені від мишей, яким трансплантували старі штрих-коди HSC (трансплантація 1 °), яким повністю відсутнє відновлення Т-клітин (зменшення вироблення Т-клітин є ознакою старіння HSC). Штрих-коди в отриманих лініях iPS досліджували на предмет перекриття з потенціалом ліній окремих HSC, отриманих на етапі 3a. Далі було використано п’ять iPS-ліній для створення iPS-химер шляхом доповнення бластоцист та морули, штрих-коди яких пов’язані з фаскою мієлоїдних ліній (крок 4). HSC в химері iPS досліджували як на функціональні, так і на молекулярні параметри кровотворення, і їх результати порівнювали з молодими (функціональні та молекулярні аналізи), середнім віком (молекулярні аналізи) та старими HSC (молекулярні аналізи; етап 5).
Повнорозмірне зображення
a ) Генерування периферичних Т-клітин з HSC із штрих-кодами у трансплантатах 1 °, химерах iPS та трансплантатах 2 °. Показана середня частота (%) ± sd між усіма тестованими клітинами (n = 5 та 22 миші для трансплантації iPS відповідно, 2 °). Клітини на ділянках FACS попередньо генедовані на одиничних, життєздатних клітинах CD45.2 +, GFP +, CD11b та на одиничних, життєздатних клітинах бластоцисти CD45.2 +, CD11b (химери iPS) та трансплантатах 2 °. b ) генерування Т-клітин у химерах iPS химер та при трансплантації 2 °. Середня частота (%) ± sd CD4 - CD8-, CD4 + CD8-, CD4 + CD8 + та CD4 - CD8 + серед усіх CD3 + тимоцитів, отриманих з досліджуваних клітин, вказана у відповідних воротах. Клітини попередньо огороджені на одинарних, життєздатних -, CD3e +, CD45.1 +/CD45.2 + лініях для молодих контролерів та клітинах, отриманих з CD45.2 + iPS. Дані наведені в одному експерименті (первинні та вторинні химери) для кожної лінії iPS.
Повнорозмірне зображення
Стіл в натуральну величину
Щоб оцінити потенціал гемопоетичної репопуляції клітин, отриманих iPS, ми додатково пересадили клітини BM з химери бластоцисти/морули у смертельно опромінених господарів (рис. 1, трансплантація 2 °). Завдяки суміші похідних iPS та ендогенних у первинних химерах, ці експерименти мають конкурентний характер. Це показало, що як кількісно (рівні клітин, отримані донорами), так і якісно (внесок у кожну оцінену лінію) від кожного з похідних iPS HSC (iPS-HSC) були подібними до показників ендогенних (молодих) контрольних HSC (таблиця 1). Оскільки батьківські HSC повністю відсутні в лінії Т-клітин (малюнки 2f та 3a), ми доповнили наші обстеження більш детальним аналізом розвитку Т-клітин в iPS та чебрець для трансплантації 2 ° (рис. 3). Це дозволило виявити порівнянні частоти CD3 + CD4 - CD8-, CD3 + CD4 + CD8 +, CD3 + CD4 + CD8- та CD3 + CD4 - CD8 + клітин з ендогенними (молодими) контрольними клітинами (рис. 3b) та перевірено на стійку регенерацію. - визначення компетентності Т-клітин з батьківських донорських клітин, некомпетентних з Т-клітинами.
Повнорозмірне зображення
обговорення
Більшість органів містять популяції дорослих/соматичних стовбурових клітин, які функціонують для підтримки гомеостазу на все життя. Враховуючи дедалі більші докази того, що дорослі стовбурові клітини не шкодують старіння, здається розумним, що значне зниження функції тканин із віком зумовлене зміненою функцією пов’язаних із ними стовбурових клітин. У той же час кожну групу старіючих стовбурових клітин слід вважати потенційно неоднорідною; або тому, що окремі стовбурові клітини можуть бути задані по-різному з молодого віку, різний досвід, з яким стикається онтогенез вивільнення окремих стовбурових клітин, або поєднання цих фактів. Тому при вивченні перспектив зворотного старіння клітин важливо мати функціональний підхід на відміну лише від хронологічно старих клітин.
методи
Миші Rosa26 rtTA; Col1a1 4F2A (миші 4F2A) люб'язно надав Dr. Рудольфа Яніша та були отримані через лабораторію Джексона (складський номер 011004). Клітини цих мишей експресують oct4, Klf4, Myc та Sox2 після добавки доксицикліну 22. Усі миші були фоновими C57BL/6 і мали комбінацію вроджених маркерів CD45.1, CD45.2 або F1CD45.1 x CD45.2. Тварини були розміщені в приміщеннях для тварин при університеті Лунда та Копенгагенському університеті. Усі експерименти на тваринах проводились із схвалення місцевих комітетів з етики. Для експериментів використовували як самців, так і жінок.
Імунофенотиповий аналіз та сортування клітин
Дослідження клональності старіння HSC
Виведення клітин iPS
Генерація та характеристика клонів конкретних химерних мишей
iPS-химери. Відібрані iPS-клони (спочатку CD45.2 +) вводили в морулу та бластоцисти від мишей CD45.1 + /.2 + у базовій трансгенній миші (Університет Копенгагена, Данія). Отримані химери досліджували на колір шерсті агуті, методом ПЛР проти певного штрих-коду та наявності CD45.2 + позитивних клітин у PB. У віці 11-14 тижнів химерних мишей забивали, а їх BM, PB та чебрець збирали для аналізу та сортування FACS.
2 ° трансплантація. Для вивчення конкурентоспроможності HSC, отриманих iPS, чотирьом-п’яти смертельно опроміненим (950 cGy) мишам CD45.1 + або CD45.1 + /.2 + F1 віком від 8 до 14 тижнів трансплантували 2 x 10 6 нефракціонованих клітин BM з кожна iPS-химера. FACS PB регулярно оцінював відновлення багатолінійності.
Для вивчення молекулярної подібності HSC, отриманих iPS, до HSC різного хронологічного віку, ми спочатку відібрали 3 високоекспресовані гени, пов'язані з HSC, 3 референтних гена (Actb, Hprt та Gapdh) та 42 гени, диференційовано експресовані в HSC за віком. Друга категорія була отримана шляхом аналізу раніше опублікованих даних мікрочіпів щодо стабільного стану HSC молодих та вікових груп (шість полів на вік). Дані були попередньо оброблені шляхом вилучення значень рівня виразності зонда з використанням RMA 25 та подальшого аналізу за допомогою dChip 26 шляхом фільтрування зондів із виразом нижчим за 50 у всіх підмножинах для усунення шуму та з диференціальним виразом, меншим ніж у 1,5 рази. Далі вгору і вниз регульовані гени використовувались як набори генів для аналізу збагачення наборів генів 27 стаціонарних масивів молодих та вікових груп HSC та 42 гени були обрані з передових списків генів цих аналізів.