предметів
Хронічний лімфолейкоз (ХЛЛ) характеризується накопиченням у крові та первинних лімфоїдних органах тривалих, зрілих, але нефункціональних лімфоцитів групи В. Відомо, що взаємодія лейкозних клітин з мікросередовищем є критично важливою для виживання клітин ХЛЛ in vivo. Клітини CLL можуть довго виживати in vivo, тоді як клітини швидко проходять апоптоз in vitro. Цей спонтанний апоптоз та лікарська чутливість клітин ХЛЛ, що спостерігаються in vitro, сильно знижуються у присутності стромальних клітин, 2, 3, 4, 5, які забезпечують подразнення клітин ХЛЛ головним чином за допомогою прямого контакту. Таким чином, імітація умов in vivo для дослідження механізмів, що беруть участь у стійкості до ХЛЛ, вимагає створення кокультурних систем. МікроРНК (miРНК) є важливими регуляторами експресії генів і сприяють патології ХЛЛ. 6, 7, 8 Нещодавно було описано велику зміну рівня міРНК у клітинах ХЛЛ після безпосереднього культивування на стромальних клітинах. 9, 10
Повнорозмірне зображення
Для подальшого підтвердження наших результатів ми провели кокультурні експерименти клітин ХЛЛ з різними типами стромальних клітин. Клітини CLL збирали через 24 години з допомогою обережного піпетування для отримання всіх клітин CLL. Ретельне мікроскопічне дослідження підтвердило загальну цілісність моношару стромальних клітин. Аналіз мікроРНК отриманих клітин показав різке збільшення рівнів miR-99a та miR-125b (рис. 2а), підтверджуючи результати, описані Willimott та Wagner 9, використовуючи клітини стромальних клітин фібробластів миші. На відміну від цього, збільшення рівня miR-9, зареєстроване в клітинах CLL після культивування на фібробластах миші 9, не було виявлено після культивування на клітинах BM-MSC або HMEC-1 (дані не наведені). Цікаво, що miR-9 не вдалося виявити в клітинах BM-MSC та HMEC-1, але більше його було в клітинах NIH/3T3.
Вплив забруднення стромальних клітин на рівні міРНК у суспензіях клітин ХЛЛ. Клітини CLL культивували в шестилункових планшетах при 3 х 10 6/мл на 60% злитих стромальних клітинах протягом 24 годин. miR-99a та miR-125b були виявлені RT-qPCR за допомогою аналізів мікроРНК TaqMan. ( a ) Рівні мікроРНК у клітинах ХЛЛ після культивування на BM-MSC або HMEC-1. Клітини CLL отримували, обережно піпетуючи вгору і вниз. Результати нормалізувались до РНК U6. ( b ) Кількісне визначення мікроРНК у клітинах CLL, культивованих окремо та змішаних із супернатантами стромальних клітин. Супернатанти стромальних клітин та суспензії ХЛЛ видаляли з лунок без попереднього піпетування, щоб запобігти поділу клітин. ( c ) Рівні мікроРНК у клітинах ХЛЛ та гранулах, отриманих із супернатантів стромальних клітин. Результати представлені у значеннях Ct, що відповідають RT-qPCR з рівними обсягами РНК. ( d ) Кількісне визначення мікроРНК у клітинах ХЛЛ, навмисно забруднених стромальними клітинами у співвідношенні 1: 1000 стромальних: клітин ХЛЛ. Результати нормалізувались до РНК U6.
Повнорозмірне зображення
Щоб визначити можливий перенос міРНК від стромальних клітин до клітин CLL через позаклітинні везикули 13 або через міжклітинний міжклітинний зв’язок (GJIC), 14 клітин CLL та стромальні клітини спільно культивували з мембраною (пори 0,4 мкм, Transwell, Corning, Amsterdam, .) Або у присутності 1-октанолу інгібітора GJIC (0,5 мкМ, Sigma, Diegem, Бельгія). Ми виявили, що мембрана скасувала підвищення рівня miR-99a та miR-125b у клітинах CLL, тоді як інгібітор GJIC не виявив ефекту (дані не наведені). Ці результати унеможливлюють перенесення цих мікроРНК із стромальних клітин в клітини ХЛЛ позаклітинними везикулами або GJIC.
Підсумовуючи, представлені спостереження підкреслюють, що в конкретних експериментальних умовах дуже обмежена кількість забруднюючих клітин може призвести до результатів артефактів з точки зору кількісного визначення мікроРНК. У цьому звіті наголошується на необхідності належного контролю в складних системах співпраці. У світлі цього дослідження сортування клітин із змішаних популяцій клітин до чистоти до 99,9% не завжди може запобігти неправильним висновкам щодо експресії міРНК. Через високу чутливість сучасних методів подібні занепокоєння можуть стосуватися аналізів мРНК та білків.
Додаткова інформація
Файли PDF
Додаткова таблиця
Внески автора
JP та EM розробили та провели дослідження, проаналізували дані та написали рукопис; ГБ завербував пацієнтів з ХЛЛ та відредагував рукопис.