Попередження: Ця сторінка є перекладом цієї сторінки оригінально англійською мовою. Зверніть увагу, оскільки переклади генеруються машинами, не те, що всі переклади будуть ідеальними. Цей веб-сайт та його сторінки призначені для читання англійською мовою. Будь-які переклади цього веб-сайту та його веб-сторінок можуть бути неточними та неточними повністю або частково. Цей переклад надається для зручності.
Технології білкової інженерії є важливою частиною налаштування або отримання білків зі специфічними властивостями, які можуть застосовуватися в різних промислових процесах. Таким чином, вони мають вирішальне значення для біотехнологічних досліджень.
Однак ці методи значною мірою покладаються на можливість виділення та очищення бажаних білків, щоб зрозуміти їх фізичні та хімічні властивості, а також їх третинну структуру та взаємодію з лігандами та субстратами.
Інтенсивність, на якій здійснюється цей процес очищення, залежить від того, як застосовувати білок. Наприклад, фармацевтичні та харчові білки потрібно довести до нахилу високої чистоти та пройти кілька послідовних етапів, що є унікальним можливим, оскільки на кожному етапі частина білка неминуче втрачається.
Очищення молекул білка простіше, ніж очищення білкових комплексів.
Крок 1: Створіть екстракт сирого білка
Сирі екстракти внутрішньоклітинних білків готують шляхом лізису клітини за допомогою хімічних або механічних процесів. Потім сміття видаляють центрифугуванням. Отриманий супернатант є далеко не чистою формою, оскільки змішується з багатьма іншими макро- та мікромолекулами.
Позаклітинні білки отримують центрифугуванням розчину та видаленням клітин. Конкретним методом отримання сирого екстракту термостабільних ферментів є нагрівання суміші для денатурації інших білків, а потім охолодження для реформування термостабільних білків, що нас цікавлять, нарешті, центрифугування для видалення денатурованих білків.
Крок 2: проміжне очищення
Соління
Потім білки в неочищеному екстракті очищають, осаджуючи їх у висококонцентрованому розчині солі, такому як сульфат амонію. Це працює на основі меншої розчинності білка при високих концентраціях солі. Однак усі білки не випадають в осад при однаковій концентрації солі, а це означає, що соління також сприяє розщепленню білків. Також його можна використовувати для концентрування білків у розчині. Цей етап збільшує чистоту втричі, і 92% білка в розчині відновлюється.
Діаліз
Білки - це великі молекули, і це означає, що солі білків будуть збережені, пропускаючи розчин через напівпроникну мембрану. Целюлоза - типова діалізна мембрана. Діаліз не можна використовувати для розділення білків різної молекулярної маси.
Хроматографія
Інші методики, що застосовуються для видалення солених білків, включають хроматографію та гель-фільтрацію. Зараз вони доступні як готові набори для багатьох стандартних білків і часто підходять для широкомасштабних процесів.
Гель-фільтрація працює на основі поділу розміру через колонку з пористих форм полімеру, таких як декстран або агароза. Великі молекули можуть протікати лише через проміжки між ліпними деталями, тоді як менші молекули займають ці простори та простір усередині ліпнини, зменшуючи їх. Таким чином, елюенти містять нові молекули в порядку їх розміру, від найбільшого до найменшого. Також використовуються методи зворотної фази або іонообмінної хроматографії, які діють на основі диференційованих гідрофобних властивостей і заряду відповідно. Зворотна хроматографія може бути обмежена у використанні через можливу денатурацію білка органічними розчинниками.
Діаліз та іонообмін дають розчин, який у 9 разів чистіший, але лише 77% вихідного білка, який зараз доступний. Після гель-хроматографії на виході вихід становить лише 50%, але чистота в сто разів.
Крок 3: Остаточне очищення
Афінна хроматографія
Цей процес залежить від використання зв’язаних лігандів для біделетів, які специфічно зв’язуються з цікавим білком, який потім можна промити іншим розчином вільних лігандів. Це призводить до надзвичайно чистих зразків білка, які мають найвищу питому активність серед усіх методів, що використовуються в даний час. Прикладом є очищення конканавіліну А з використанням залишків глюкози, прикріплених до гранул у колонці. Зараз розчин найчистіший у 3000 разів, але вихід становить лише 35% від вихідного білка.
Електрофорез у поліакриламідному гелі
Електрофорез у поліакриламідному гелі використовується для виявлення чистоти зразка білка після кожного етапу залежно від розміру. Чистий заряд на молекулі змушує колонку або лист гелю падати в електричному полі, дозволяючи білкам відокремлюватися залежно від швидкості їх міграції, яка, в свою чергу, залежить від їх заряду, а також від тертя та сили поля. Гель діє як хімічно інертний та легко утворюється фільтр, при цьому молекули білка майже не рухаються у колонці, оскільки вони прилипають між значно меншими порами між молекулами гелю. Спочатку візуалізується серія смуг, що представляють різні білки в суміші, які поступово зменшуються у великій кількості, поки на останньому етапі не буде показано лише одну смужку.
Імуноблотинг
Імуноблотинг - ще одна корисна техніка, яка часто поєднується з афінною хроматографією. Він використовує антитіла так, що білок виділяється у вигляді лігандів у колонці. Антитіло іноді піддають дії ізотопів або барвників, щоб мітити їх та полегшувати виявлення після поділу.
Будь-яка хроматографічна техніка вдосконалюється за допомогою тиску, щоб проштовхувати розчин через колонку з тонкоподрібненими матеріалами, навантаженими або відформованими лігандами. Збільшення площі поверхні призводить до найбільшої взаємодії, що підвищує роздільну здатність і швидкість техніки. Це називається високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ).
Всі ці етапи включені в ідеальну схему, яка повинна зосереджуватися на рівнях виходу та очищення, щоб забезпечити достатню кількість білка для проведення експерименту, а також запропонувати достатню чистоту, щоб зробити інтерпретацію відносно простою.
Список літератури
Подальше читання
Доктор Ліджі Томас
Доктор Ліджі Томас - лікар-гінеколог, який закінчив Урядовий медичний коледж Університету Калікута, штат Керала, в 2001 році. Лідзі кілька років після закінчення навчання працювала штатним консультантом з акушерства/гінекології в приватній лікарні. . Вона консультувала сотні пацієнтів, які стикаються з проблемами, пов'язаними з вагітністю та безпліддям, і керувала понад 2000 пологів, намагаючись завжди досягти нормальних пологів, а не оперативного.
Цитати
Будь ласка, використовуйте один із наступних форматів, щоб цитувати цю статтю у своєму есе, роботі чи доповіді:
Томас, Лідзі. (2019, 26 лютого). Методи очищення білка. Новини-Медичні. Отримано 12 січня 2021 року з https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.
Томас, Лідзі. «Техніка очищення білка». Новини-Медичні. 12 січня 2021 року. .
Томас, Лідзі. «Техніка очищення білка». Новини-Медичні. https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx. (доступ 12 січня 2021).
Томас, Лідзі. 2019. Техніка очищення білка. News-Medical, переглянутий 12 січня 2021 р., Https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.
News-Medical.Net надає цю медичну інформаційну послугу відповідно до цих умов. Зверніть увагу, що медична інформація, розміщена на цьому веб-сайті, призначена для підтримки, а не для заміщення стосунків між пацієнтом та лікарем/лікарем та медичної консультації, яку вони можуть надати.
News-Medical.net - Сайт AZoNetwork