предметів
реферат
Миші C57BL/6 (B6) від Taconic Sciences (Tac) та лабораторії Джексона (Jax) були інфіковані H. pylori PMSS1 (Hp) протягом 16 тижнів; не було значної різниці в гістологічній активності шлунку між інфікованим Hp Tac та Jax B6. Однак ступінь метаплазії слизової оболонки шлунка та рівні Th1-асоційованих IgG2c у відповідь на Hp-інфекцію зростали у мишей Tac у мишей Jax, тоді як рівні колонізації Hp шлунка були в 8 разів вищими порівняно з Tac B6 у Jax B6. Крім того, експресія мРНК IL-1β, IL-17A та RegIIIγ шлунку була значно нижчою у заражених Tacs порівняно з інфікованими мишами Jax. Були значні відмінності у структурі мікробних спільнот шлунку, товстої кишки та стільця між жінками Jax та Tac B6. Вважається, що відмінності в мікробних спільнотах шлунка між самками Jax та Tac B6 впливають на метаген. Крім того, Hp-інфекція порушила структури мікробних спільнот у шлунку, товстій кишці та фекаліях мишей Jax, але лише змінила мікробний склад товстої кишки у мишей Tac. Наші дані показують, що шлунково-кишковий мікробіом мишей Tac B6 композиційно відрізняється від мишей Jax B6, що, ймовірно, призвело до різних патологічних, імунологічних та мікробних реакцій на Hp-інфекцію.
Інфекція хелікобактер пілорі може спричинити хронічний активний гастрит, пептичну виразку та є основним фактором ризику розвитку аденокарциноми шлунка 1, 2. Приблизно 50% населення планети інфіковано цим збудником,
10% з них викликають виразкову хворобу шлунка або дванадцятипалої кишки та
Вражених Th1 мишей C57BL/6 використовували для визначення механізмів запального канцерогенезу шлунка, індукованого інфекцією H. pylori 15. Різні клубові мікробіоти спостерігали у мишей C57BL/6 від Jackson (Jax) та Taconic Bioscience (Tac) 16. Зокрема, сегментовані нитчасті бактерії (SFB), група грампозитивних спороутворюючих бактерій, є у мишей Tac, але відсутні у мишей Jax. SFB сприяє протизапальній реакції клітин Th17, а також відіграє важливу роль у стимулюванні реакцій IgA слизової оболонки 16, 17, 18, 19, 20, 21. Враховуючи роль мікробіома і особливо SFB у формуванні імунної відповіді господаря, ми висунули гіпотезу, що інфекція H. pylori викликає патологічні ефекти та імунні відповіді, диференційовані у мишей C57BL/6 з різними шлунково-кишковими мікроорганізмами, що може дати нове розуміння ефектів різних мікробіотів ШКТ. про індуковану H pylori патологію шлунка у людини. У цьому дослідженні були охарактеризовані тяжкість шлункової патології, експресія медіаторів запалення, мікробіома шлунково-кишкового тракту (ШКТ) (шлунок, товста кишка, кал) та динаміка колонізації SFB у відповідь на інфекції H. pylori у мишей Jax та Tac C57BL/6 та порівняно.
результат
У інфікованих H. pylori мишей Tac розвинулася більш важка метаплазія слизової оболонки шлунка, ніж у інфікованих pylori H. мишей.
Через 16 тижнів після щеплення H. pylori (16 WPI) інфекція H. pylori індукувала значно більш важку патологію шлунка як у мишей Tac, так і у Jax B6 порівняно з їх фіктивними контролями (рис. S1, P 
Виразність метаплазії слизової була збільшена у мишей H., інфікованих Tac B6 pylori, порівняно з їх аналогами Jax. ( A ) Оцінка (зростаюча від 1 до 4) метаплазії слизової оболонки шлунка, яка була більш важкою у заражених мишей Tac. ( B ) Репрезентативні зображення, що демонструють патологічні особливості між групами.
Повнорозмірне зображення
Для подальшої характеристики походження слизової метаплазії ми вивчили закономірності експресії маркерів метаплазії слизової (Tff2) та SPEM (Tff2, GSII-лектин) у тканинах шлунка за допомогою імуногістохімії 22, 23, 24. У шлунковому тілі як контролів Jax, так і Tac дуже слабка експресія Tff2 обмежувалась клітинами слизової оболонки шийки матки та відбором базальної залози, тоді як у мишей, інфікованих H. pylori, підвищене та de novo імунофарбування гіперпластичних та метапластичних залоз та/або фовеолярних лунок. спостерігався і у багатьох вогнищах, які поширювались по всій довжині слизової оболонки (рис. 2А). Крім того, експресія Tff2 була більш вираженою у шлунку мишей, інфікованих H. pylori, порівняно з мишами, інфікованими Jax, головним чином у сегментах, які зазнали метаплазії слизової оболонки, що корелює зі збільшенням метаплазії слизової, що спостерігається у мишей, інфікованих Tac. Подібним чином у шлунку контролів обох постачальників було відзначено кілька GSII-позитивних залоз (рис. 2В). На відміну від цього, експресія шлункового лектину у шлунку була значно збільшена у всіх інфікованих мишей порівняно з неінфікованими контролями. Крім того, експресія GSII-лектину була збільшена в зараженому Tac B6 порівняно з інфікованим H. pylori Jax B6 (рис. 2B).
Експресія Tff2 та GSII була підвищена при інфекції шлункового тіла Tac B6 порівняно з аналогами Jax. ( A ) Tff2 IHC a ( B ) Імунофлюоресценція GSII.
Повнорозмірне зображення
Ступінь колонізації шлунка H. pylori були значно вищими у мишей Jax порівняно з мишами Tac
Відповідні за віком миші C57BL/6 інфікували H. pylori PMSS1 протягом 16 тижнів. Усі інфіковані миші Jax були позитивними на H. pylori, тоді як 4 з 10 заражених мишей Tac були негативними на H. pylori (рис. 3А). Крім того, середній рівень шлункової Н колонізації. pylori були у 8 разів вищими у мишей Jax (3317 ± 1345) порівняно з рівнем у H. pylori-позитивних мишей Tac (452 ± 219) без статистичної значущості (рис. 3А, Р = 0,064).
Зафіксовано наявність клубової SFB, що викликає стійку відповідь Th17 16. Таким чином, рівні транскриптів усіх генів, випробуваних на тканинах шлунка, також вимірювали в клубовій кишці як інфікованих, так і контрольних мишей. Рівні транскриптів IL-17A та Ifnγ значно зросли у мишей Tac порівняно з мишами Jax (рис. S2). Рівні мРНК Ineal Tnfa, Il-1p, Il-22, Il-10, Foxp3 та RegIIIy були порівнянними між мишами Tac та Jax незалежно від статусу інфекції.
Інфекція H. pylori значно підвищила рівень колонізації SFB в товстій кишці мишей Tac B6
Використовуючи специфічний для SFP qPCR 26, ми відстежували рівень SFB у фекаліях з часом у мишей Jax та Tac, а також вимірювали динаміку колонізації SFB в клубовій кишці, апендиксі та товстій кишці. Усі миші Jax мали SFB-негатив у аналізованих тканинах. Навпаки. SFB були присутніми в калі та клубовій кишці всіх мишей Tac, а вибрані миші мали позитивний вміст SFB у товстій кишці та сліпій кишці (рис. 4). Після одного тижня мишей Tac B6, розміщених у MIT, рівні SFB у фекаліях значно знижувались порівняно з рівнями після прибуття (рис. 4А). Згодом рівень SFB поступово знижувався з 2 до 16 WPI. Інфекція H. pylori суттєво не змінила рівні SFB у фекаліях, за винятком 4 WPI, тоді як інфекція H. pylori значно підвищила рівень SFB у фекаліях.
Коли аналіз бета-різноманітності був проаналізований за допомогою незваженого UniFrac, мікробна флора з кожного пробного місця була згрупована переважно постачальником (рис. 5). Аналіз PCoA показує, що в шлунку (P
Порівняння мікробних структур шлунку, товстої кишки та стільця між мишами Jax та Tac B6. Основний координатний аналіз (PCoA) (незважений UniFrac) проводили на основі послідовностей бактеріальних генів 16S рРНК на тій же глибині зразка (2743). Зразки мишей Jax (оранжеві) та Tac (червоні) показані у вигляді кольорових кружечків. Значення P обчислюються на відповідній незваженій роздільній матриці UniFrac з використанням аналізу ADONIS та 14, тоді як інше дослідження повідомило, що H лише суттєво порушували лише окремі групи бактерій, але не загальні структури мікробної спільноти шлунка самок мишей Tac B6., пілорі інфекція 30. Оцінка впливу інфекції H. pylori на альфа-різноманітність у мишей показала, що інфекція H. pylori не змінила різноманітності шлунку, товстої кишки або стільця мишей Tac або Jax. Хоча інфекція H. pylori не суттєво змінила різноманітність мишей В6, аналізи PCoA (незважений UniFrac за допомогою аналізу ADONIS) показали, що інфекція H. pylori суттєво змінила мікробні структури шлунку, товстої кишки та фекалій мишей Jax B6 (P
Стіл в натуральну величину
обговорення
Миші C57BL/6 (B6) широко використовувались у біомедичних дослідженнях завдяки глибоким знанням їх генетичного профілю та їх використанню в ряді трансгенних штамів мишей. У цьому дослідженні ми продемонстрували, що існують різні реакції на інфекцію H. pylori у самок мишей В6, отриманих від лабораторії Джексона (Jax) проти Taconic Biosciences (Tac). Інфіковані миші Jax B6 мали вищий рівень колонізації шлунку H. pylori, збільшення транскрипції шлункових Іл-1β та Іл-17А порівняно з інфікованими аналогами Tac. Крім того, спостерігалася більш важка метаплазія слизової шлунка та сильніша відповідь Th1-асоційованого IgG2c на H. pylori у заражених мишей Tac B6 порівняно з інфікованими мишами Jax B6. Крім того, дані мікробіомів показали, що велика кількість та однорідність мікробних композицій у шлунку, товстій кишці та стільці суттєво різнилися між штамами Jax та Tac B6. Інфекція H. pylori суттєво змінила структури мікробних спільнот на всіх досліджених ділянках (шлунок, товста кишка та кал) у самок Jax B6, але лише змінила структури мікробних спільнот у товстій кишці аналога Tac. Ці висновки вказують на те, що певний штам миші з різними мікробними препаратами може розвивати різні імунні відповіді господаря та патологічні зміни, викликані H. pylori. .
SFB у мишей Tac B6 у нашому дослідженні постійно та переважно колонізував клубову кишку незалежно від статусу інфекції, що було пов'язано із більш ніж 100-кратним збільшенням мРНК клубової IL-17A, але не Tnfa та мРНК IL-1β порівняно з обома H. миші, заражені пілорі, та контрольні миші Jax. Рівні мРНК ileal Ifnγ також були збільшені у всіх мишей Tac B6, що може бути частиною відповіді господаря на підтримку гомеостазу популяції клітин Th17. Однак більш важка метаплазія слизової оболонки шлунка та зменшення H. Рівень колонізації Pylori у мишей Tac B6, здається, не був безпосередньо обумовлений наявністю SFB, оскільки рівні мРНК шлункового IL-17A були порівнянними між мишами Tac B6 та контролями Jax B6. Однак інфекція H. pylori підвищила рівень колонізації SFB в товстій кишці, що узгоджується з нашими попередніми знахідками у мишей Tac Swiss Webster, заражених H. hepaticus 26. Оскільки клітини Th17 можуть виступати захисником хазяїна проти зараження широкого спектру патогенних мікроорганізмів 40, SFB може відігравати важливу роль у формуванні та підтримці мікробних структур шлунково-кишкового тракту у мишей Tac B6, які за своїм складом відрізнялися від таких у мишей Jax B6. патологічні та імунологічні відповіді мишей Tac B6 на інфекції H. pylori .
Загалом, ми показали, що миші B6 від Jax та Tac містять різні структури мікробної спільноти шлунково-кишкового тракту та розвивають різну імунну, патологічну та мікробну реакції на інфекції H. pylori. Відмінності в мікробіомах шлунково-кишкового тракту між мишами Jax та Tac B6 можуть бути результатом різної практики вирощування житла між постачальниками, а також фенотипових та генетичних варіацій між цими підштамами C57BL/6 29, 41. Взаємодія Х. pylori та шлунково-кишкова мікробіота, а наслідки патологічного результату стають все більш очевидними як у мишей, так і у людей. Наші висновки додатково підкреслюють важливість визначення джерела тваринних моделей, що використовуються в конкретному дослідженні, враховуючи, що один і той самий інбредний штам миші може мати різні мікробні спільноти ШКТ, які можуть диктувати різні реакції на дане експериментальне лікування.
Матеріали і методи
Миші та інфекція
Мишей утримували в установі, акредитованій Асоціацією з оцінки та акредитації лабораторних доглядів за тваринами. Всі процедури догляду за тваринами та експериментальні процедури були затверджені Комітетом з догляду та використання тварин Массачусетського інституту відповідно до Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин. П'ятнадцять 4-тижневих самок мишей C57BL/6 (B6) були придбані у Taconic Biosciences (Tac) (Germantown, NY) та лабораторії Джексона (Jax) (Bar Harbor, ME) відповідно. Миші не мали відомих мишачих вірусів Helicobacter spp. і паразитів, і їх утримували в статичних мікроізоляторних клітках та годували дієтою (ProlabRMH3000) від PMI Nutrition International (Річмонд, Індонезія) ) . Пробувши тиждень у карантині, 10 мишей від кожного постачальника були щеплені H. pylori PMSS1 (містить функціональний CagA), де 5 контрольних мишей кожного постачальника, які були розміщені в окремій кабіні, були підробленими дозаторами транспортного засобу. Миші отримували 0,2 мл свіжого посівного матеріалу (
2 × 10 8 організмів) шляхом шлункового введення через день протягом загальних трьох прищеплень.
Розтин та гістопатологія
Зразки калу у кожної миші В6 збирали до щеплення, через 2, 4, 8 та 16 тижнів після щеплення H. pylori (WPI). Всі інфіковані та контрольні миші з кожної групи були евтаназовані при 16 WPI. Відразу після евтаназії мишей з CO 2 зразки шлунка з меншої кривизни, що простягається від плоского лісомаху через проксимальну дванадцятипалу кишку, були зібрані та оброблені, як описано раніше 31, 42. Ураження шлунка класифікував порівняльний патолог (С. Мутупалані), засліплений для відбору зразків за зростанням від 0 до 4 щодо запалення, дефектів епітелію, атрофії, гіперплазії, псевдопілоричної метаплазії, дисплазії та слизової метаплазії, як визначено в іншому місці 31. Індекс гістологічної активності шлунка (GHAI) був сформований шляхом поєднання балів за всіма критеріями. Крім того, цекоколічний зв’язок і товста кишка були вбудовані в парафін, розділені на 5 мкм і забарвлені гематоксиліном та еозином для гістологічної оцінки з використанням тієї самої бальної системи, що описана раніше 43 .
Підготовка ДНК та РНК із зразків тканин та калу
Вміст у шлунку та кишечнику видаляли промиванням стерильним PBS. Шматок шлункової тканини, що містить антральний та корпусний відділи та односантиметрові сегменти клубової кишки, сліпої кишки та товстої кишки для виділення РНК чи ДНК, збирали та заморожували у рідкому азоті відразу після відбору проб та зберігали при -70 ° C перед використанням. Загальну ДНК із зібраних тканин та зразків калу виділяли за допомогою набору для підготовки шаблону High Pure PCR (Roche, Applied Science, Indianapolis, IN) та за допомогою міні-набору QIAamp Fast DNA Stool Mini відповідно до протоколу постачальника (Qiagen Inc., Валенсія, CA), відповідно. Загальну РНК із тканин шлунку та кишечника виділяли із застосуванням реагентів Trizol згідно з процедурою постачальника (Invitrogen, Carlsbad, CA). Чистоту підготовленої ДНК або РНК аналізували за допомогою Nanodrop 2000C (Thermo Scientific, Wilmington, DE).
імуногістохімія
Зрізи шлунка з усіх груп фарбували специфічним поліклональним кролячим анти-Tff2 IgG 22. Крім того, клітини слизової оболонки шлунка ідентифікували за допомогою кон’югованого флюоресцеїну ізотіоціанатом (FITC) грифонії (Bandeiraea) simplicifolia лектину II (GSII), а предметні стекла встановлювали за допомогою Vectashield плюс DAPI (4, 6-діамідино-2-феніліндол) (Vector Laboratories, Burlingame, Каліфорнія). Звичайну імуногістохімію проводили, як описано раніше, з незначними модифікаціями 22. Антигени отримували при низькому та високому рН, залежно від антитіл, інкубацією протягом 45 хвилин при 95 ° C, а предметні стекла фарбували за допомогою автоматизованого фарбувальника (Lab Vision Autostainer 360; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США) послідовно з використанням 10-хвилинного блоку пероксидази Ультравізіону, 30-хвилинного блоку гризунів R, первинних антитіл протягом 30 хвилин, а потім відповідного вторинного полімерного анти-кролячого IgG на основі поліамінобензидину та забарвленого H&E. Слайди зневоднювали та очищали, а потім закривали, щоб якісно оцінити схеми експресії різних маркерів.
ІФА
Використані методи були такими, як опубліковані раніше 12 .
Секвенування та аналіз генів 16S рРНК
Експресія виділених цитокінів
Для відносного кількісного визначення іРНК вибраних генів загальну РНК із шлунку та клубової кишки мишей В6 готували з використанням реагенту Trizol відповідно до рекомендацій виробника (Invitrogen, Carlsbad, CA). П’ять мкг загальної РНК з кожного зразка перетворювали в кДНК за допомогою набору архівів кДНК високої ємності (Life Technologies). Рівні мРНК Ifnγ, Tnfα, Il-1β, Il-17A, Il-22, RegIIIγ, Il-10 та Foxp3 у тканинах шлунку та клубової кишки вимірювали за допомогою qPCR за допомогою комерційних праймерів та зондів (аналізи експресії генів TaqMan) у 7500 ШВИДКА ПЛР-система в реальному часі. Рівні транскриптів нормалізували до ендогенної контрольної мРНК гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (Gapdh) і виражали як кратну зміну у відношенні до фіктивних контролів (визначених як 0) за допомогою методу порівняльного порогового циклу (CT) ).
Статистичний аналіз
Дані про рівні SFB, H. Експресію пілорі та цитокінів аналізували серед кількох груп, використовуючи тест Крускала-Уолліса, та між двома групами, використовуючи тест t непарного студента. U-тест Манна-Уїтні був використаний для аналізу оцінок GHAI між групами. Значення Р