АНОТАЦІЯ

Доступ надано

ВСТУП

Нітрофурани - це група потужних антибактеріальних препаратів широкого спектру дії, які також мають антипротозойну активність. Вони все ще використовуються для лікування багатьох бактеріальних та найпростіших інфекцій у тварин, що виробляють їжу по всьому світу, особливо свиней та птиці, і здатні викликати рак, а також мати інші токсичні побічні ефекти за різними моделями експериментальних моделей. 1, 2, 3 Ці докази взяті за основу заборони використання їх у здоров’ї тварин у багатьох країнах.

Ближче до кінця 1980-х років, виходячи з ідеї запобігання потраплянню канцерогенної речовини до споживачів людини згідно з Поправкою Делані, Адміністрація США з питань харчових продуктів і медикаментів заборонила використання фуразолідону (FZD) та нітрофуразону (плюс пізніше розповсюджений на фуральтадон) для лікування захворювань тварин, що виробляють їжу. Однак, з точки зору США та іноземних країн, цією забороною можна поставити під сумнів. Індукція раку була встановлена ​​у лабораторних тварин, які безпосередньо отримували великі кількості даного нітрофурану; 1, 2, 4, але людині не загрожує споживання агента нітрофурану з тваринних джерел їжі, а залишків основних метаболітів: 2,3-дигідро-3-ціанометил-2-гідрокси-5-нітро-1альфа, 2 -di (2-оксо-оксазолідин-3-іл) імінометил-фуро 2, 3- β фуран, також званий 3-амін-2-оксазолідоном (AOZ), і незначний метаболіт, N- (5-аміно -2- фурфуриліден) -3-аміно-2-оксазолідон (FOZ). 5, 6 На сьогоднішній день докази того, що AOZ/FOZ може спричинити генотоксичні або канцерогенні зміни, не є остаточними.

Як і у випадку ссавців, риба метаболізує FZD в AOZ та FOZ через цитохром Р -450; отже, їх можна використовувати для вивчення канцерогенних ефектів, які можуть викликати як FZD, так і його метаболіти AOZ/FOZ. 7 Вид декоративних гінегенетичних риб, Poecilia formosa (моллі), батьки та нащадки яких генетично ідентичні, як відомо, схильний до розвитку пухлин, частково завдяки своєрідному репродуктивному процесу. 8 Цей вид вважався підходящою моделлю для перевірки канцерогенного потенціалу наркотиків, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 і може бути використаний для вивчення прямих канцерогенних ефектів ФЗД, а також непрямих ефектів . AOZ. Крім того, було проведено порівняння таких ефектів при тилапії (Oreochromis niloticus).

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ

Моллі (Poecilia Formosa)

Загалом було використано 1350 моллі, кожен довжиною 2 см і вагою приблизно 1,2 г. Рибу розподіляли у скляній тарі на 40 літрів з водообігом 50% на тиждень. Об'єм 1 л повітря/хв (Wave Pumps, W Lim Corporation, El Monte, CA, USA) закачували в кожну з них, щоб підтримувати концентрацію кисню у воді 5 ppm. Температуру води 23 ° С забезпечували за допомогою термостата. Змінні води (кисень, температура та рН) вимірювали щодня (Digital Oximeter and Precision Thermometer, American Marine Inc., Ridgefield, CT, Cherstertown, MA, USA). Вміст амонію, нітритів, жорсткість води та фосфатів вимірювали за допомогою автоматизованої системи (Aqua LaMotte, Черстертаун, Массачусетс, США).

У групі Am три повторення 100 молі отримували ліки з 11 мг FZD/кг корму/день протягом 12 тижнів. Щотижня демідулювали сім моліс на репліку і зберігали у 10% забуференному формальдегіді. Вибірку риби обробляли для гістопатологічного аналізу із застосуванням стандартного вкладання воску та фарбування методом гематоксилін-еозин. Була включена контрольна група (Am control) із 100 немедикаментозних молі. У групі Bm 300 самок, оброблених FZD, отримували ту ж дозу, що і раніше, і були розділені на три повторності та стимульовані до розмноження гуппі (Poecilia reticulata) наприкінці тижня 12. Також була встановлена ​​контрольна група без лікування 100 молі та індуковані для розведення, як зазначено вище (контроль Bm). Цуценят Вм та контрольних груп Вм годували стандартним комерційним раціоном, вільним від FZD, і як тільки вони досягли розміру 1 см, 20 риб забивали на повтор і обробляли, як зазначено вище, для гістопатологічного аналізу.

У групі Cm 350 молі, які годували FZD, перетворювались на рибне борошно через 12 тижнів прийому ліків з 11 мг FZD/кг корму. Ця рибна мука була включена в комерційні корми без часу видобутку із розрахунку 500 г рибної муки/кг товарного корму. Загалом 100 молі (група Cm 1) годували цим раціоном протягом 12 тижнів. Розрахована доза AOZ становила 1,25 мкг/кг біомаси молюсків, враховуючи витрату корму 5% від маси біомаси. Наприкінці цього періоду рибу обробляли, як описано вище, у пошуках пухлин. Також була встановлена ​​немедикаментозна контрольна група з 100 молі (контрольна См).

Тилапія (Oreochromis niloticus)

Загалом у цій фазі було використано 325 неповнолітніх самців тилапії розміром 2 см. У групу At було включено 65 риб на одну репліку та три репліки, плюс 65 додаткових риб для необробленої контрольної групи (контрольна At). Тварин призначали, як уже було описано. Риба отримувала комерційний раціон, доповнений ФЗД, у дозі 50 мг/кг корму протягом 60 днів. Наприкінці цього періоду приблизно половина з цих риб була забита та оброблена для макроскопічного та гістопатологічного аналізу, як уже було описано. Друга половина була виготовлена ​​з рибного борошна та включена в комерційний раціон із розрахунку 500 г/кг комерційних кормів. Розрахована доза AOZ становила 1,6 мкг/кг біомаси тилапії, враховуючи споживання корму 5% від маси біомаси. Групу Bt із 65 тілапії годували цією дієтою, що містить залишок FZD, протягом 12 тижнів як лікарський засіб AOZ/FOZ. Дані контролю в групі, що не отримувала лікарських засобів, також розглядалися як контрольна група для групи Bt.

Розподіл груп за двома видами риб узагальнено в таблиці 1.

Повний розмір таблиці

Рибну муку з молюсків та тилапії обробляли для виявлення AOZ та FOZ, як описано Conneely et al. 16 у трьох примірниках, використовуючи розділювальну колону Інерцілу ODS (150 × 4,6 мм ID) та 5 мМ щавлевої кислоти-ацетонітрилу (55: 45) як мобільний. Фаза з УФ-детектором при 265 нм (0,04 ауф).

Статистичний аналіз даних проводили за допомогою непараметричного точного імовірнісного критерію Фішера.

РЕЗУЛЬТАТИ

Оцінені фізико-хімічні змінні у всіх тестах з обома видами підтримували постійними, з наступними середніми значеннями: температура 23,66 ± 1,2 ° C; рН 6,7 ± 0,6; амоній 0,730 ± 0,09 мг/л; фосфати 3,0 ± 0,5 мг/л; нітрати 0,41 ± 0,5 мг/л; кисень 5,6 ± 0,2 мг/л та жорсткість води (виміряна за вмістом кальцію) 120 ± 6,5 мг/л.

ВЕРХ-аналіз виявив присутність AOZ у рибному борошні, приготованому з моллі та тилапією, у кількості 25 ± 8,5 та 32 ± 4,8 мкг/кг відповідно. В обох зразках рибної муки були виявлені лише кількісно не вимірювані сліди ЗНЗ. Ці концентрації АОЗ дозволяли дози АОЗ, еквівалентні 1,25 мкг/кг біомаси молі та 1,6 мкг/кг біомаси тилапії.

Моллі (Poecilia Formosa)

Гістопатологічні дослідження молюсків виявили чіткі ознаки стеатозу печінки у всіх зразках риб, оброблених FZD. У контрольних тварин таких пошкоджень не було. З 3-го тижня до кінця випробування у риб, які отримували ФЗД, спостерігалося чітке збільшення рівня меланогістоцитом печінки, підшлункової залози, нирок та статевих залоз. На рис. 1а та b наведені деякі приклади цих висновків. Тижнева частота виявлення пухлини меланогістоцитоми нирок (а) та/або печінки (б) була такою: жодної протягом перших 2 тижнів, потім 10, 24, 30, 36, 36, 44, 46, 48, 46 та 44, з 3-го по 12-й тиждень відповідно. Точний тест вірогідності Фішера показує, що порівняно з 1 та 2 тижнями та з контрольною групою у групи, яка отримувала FZD, спостерігалося статистично значуще збільшення пухлин з 3 по 12 тиждень (P

ефектів

Ниркові (а) та печінкові (б) меланогістоцитоми, індуковані моллі, що годували FZD (Poecilia formosa) при 0,011 г/кг корму/день протягом 12 тижнів.

Повнорозмірне зображення

Тилапія (Oreochromis niloticus)

Жодної пухлини не спостерігалось у жодної з риб, які отримували FZD, або в їжі з тілапії, що годувалася тилапією. На відміну від цього, стеатоз печінки був виявлений у всіх тилапій, оброблених FZD. У необробленої контрольної риби це ураження не виявлялося.

ОБГОВОРЕННЯ

Фізико-хімічні змінні, оцінені у воді, суттєво не змінились у жодному наборі тестів. Отже, робиться висновок, що дуже малі коливання, що спостерігаються, навряд чи матимуть якийсь вплив на спостережувані результати. Експериментальний канцерогенез із використанням видів риб як альтернативних моделей був описаний як динамічна, приваблива та цінна область досліджень. 11, 12 Poecilia formosa - це жіноча лінія живих риб, які зазнають частих мутацій, мають клональну передачу та мають принаймні два справді гіперваріативних локуси, які підтримують концепцію про те, що молюски схильні до мутаційних змін як фізичних, так і хімічних подразників. 13, 14, 15 Насправді цей вид риб вважався вигіднішим, ніж використання гризунів для тестування на потенційні канцерогени. Отже, результати цього випробування підтверджують використання цього виду риби для виявлення потенційно канцерогенних речовин.

Головною метою цього експерименту було порівняння/протиставлення ефектів годування FZD або AOZ/FOZ у двох моделях риб: одна, схильна до розвитку пухлин (Poecilia formosa), і друга (Oreochromis niloticus), що не відрізняється цим. Крім того, у випадку з моллюсками, тестували послідовні покоління, щоб оцінити можливе накопичення або геномний вплив на статеві клітини. Як і слід було очікувати, зібрані за цим слідом докази відповідають встановленому факту, що FZD є канцерогенною речовиною. 1, 2, 4, 17, 18 У цьому конкретному дослідженні тип раку, індукований FZD, визначався як меланогістіоцитома. Ці пухлини стають більш очевидними та рясними з часом впливу FZD. На відміну від них, жодної з цих пухлин не було виявлено у молі або тілапій, які годували AOZ/FOZ, забруднених моллі або тилапією, відповідно, а також у нащадків молі, які пережили 12-тижневий період лікування ФЗД.

Задача, розроблена тут, з використанням метаболітів, зв’язаних з білком FZD, проводилася при концентраціях AOZ/FOZ у рибних стравах (від моллюсків та тилапії), що значно перевищували зареєстровані концентрації AOZ у м’ясі свиней від тварин, які отримували лікарські препарати FZD. 19 Це можна пояснити процесом зневоднення, необхідним для приготування рибної муки. Ця методологія відрізняється від простого додавання АОЗ у корм, оскільки вважається, що АОЗ тварин, які отримують лікарські засоби, що отримують лікарські засоби, ковалентно пов'язані з білками тканин, таким чином більш точно нагадуючи харчовий ланцюг.

Додатковою метою цього експерименту була оцінка наслідків накопичення метаболітів FZD харчовим ланцюгом у наступних поколіннях. У цьому дослідженні не було виявлено жодного помітного ефекту. Насправді, відсутність здатності AOZ/FOZ до індукції пухлини, виявлена ​​в цих аналізах, принаймні для молі і тилапії, краще відповідає дослідженням, що демонструють відсутність мутагенності AOZ, зв’язаного з тканинами з метаболічною активацією або без неї, та використання тесту на сальмонелу/мікросому, 20 ніж заздалегідь прийняте припущення, що AOZ/FOZ потенційно є настільки токсичним для клітин, як FZD. Klee та співавт. 21 не виявили гострої токсичності АОЗ або перетравлених залишків їжі в сегментах кишечника та клітинах Сако-2 при концентраціях, які значно перевищували максимальні рівні залишків, очікувані в їжі тваринного походження після введення терапевтичних доз. Однак для того, щоб з більшою впевненістю встановити, чи безпечний AOZ/FOZ для споживачів, корисно буде повторити цей тест, використовуючи більші кількості очищених та зв'язаних з білками AOZ та FOZ, а також збільшуючи час впливу. цим агентам.

Меланогістіоцитоми - це доброякісні пухлини центрів меланомакрофагів. Ці центри чудово інкапсулюються волокнистою сполучною тканиною, головним чином у печінці та різних органах, таких як підшлункова залоза та нирки. Відомо, що ці клітини мають високу швидкість поділу клітин; тому його онкогенна відповідальність стає більшою. Здається, це вірно для Poecilia formosa, виду, якому для розвитку таких пухлин було потрібно лише 3 тижні впливу FZD. Хоча комбіновані метаболіти AOZ/FOZ підтримують лише незначні зміни в їх хімічній структурі, їх достатньо, щоб різко виключити канцерогенну активність FZD.

Стеатоз був загальною знахідкою у всіх риб, які отримували FZD, як у тилапії, так і у молі, але ця знахідка не спостерігалась у контрольних групах. Відсоток жиру в їжі був достатнім, тобто 8% для молюсків і тилапії. Оскільки контрольна риба не виявляла стеатозу, малоймовірно, що засвоюваність джерела жиру в комерційних кормах частково відповідає за цю травму. 22, 23 На відміну від цього, було показано, що FZD здатний викликати такі зміни. Однак малоймовірно, що стеатоз має якесь відношення до індукуючих пухлину властивостей FZD або відсутності цього ефекту, що спостерігається для AOZ/FOZ.

У тилапії ні відносно велика доза FZD протягом 90 днів, ні забруднена AOZ/FOZ їжа з тилапії не викликали виявлених пухлин. Ці результати також свідчать про те, що FZD не є канцерогенним для тварин, що виробляють їжу, при застосуванні в терапевтичних дозах та протягом досить обмеженого періоду часу. Насправді, всебічний огляд літератури за допомогою автоматизованих баз даних не виявив жодного посилання на прямий індукуючий пухлину ефект FZD у видів, що виробляють їжу.

Риба, яку дозують з добавкою FZD, а потім використовують для виробництва рибного борошна для годування іншої риби, виявляється достатнім кроком для позбавлення FZD властивостей, що викликають рак. Ця думка відповідає останнім доказам, що ставлять під сумнів небезпеку, яку FZD може становити для здоров'я людини при використанні як кормова добавка у ветеринарній медицині. 22 Ці результати можна виміряти в країнах, де нітрофурани все ще використовуються в галузі охорони здоров’я тварин і чиї уряди все ще перебувають під пильним контролем. Однак застосування цих результатів для оцінки ризиків для споживачів людей не було предметом дослідження і відповідальність регулюючих органів у відповідних країнах.