Короткий опис

1 КАФЕДРА ФІЗІОЛОГІЇ М`ЯЗОВО-ГЕМАТОЛОГІЧНИХ ЕФЕКТІВ ВИКОРИСТАННЯ РУЕПО У КОМБІНАЦІЇ З ЛОР.

кафедра

Опис

КАФЕДРА ФІЗІОЛОГІЇ

МУШУРНО-ГЕМАТОЛОГІЧНІ ЕФЕКТИ ВИКОРИСТАННЯ rHuEpo У КОМБІНАЦІЇ З ФІЗИЧНИМ НАВЧАННЯМ. НАСЛІДКИ ДЕМОСПРЕЗИНУ І ГІПОКСІЇ В ДОПІНГІ КРОВІ. ДО ВИВЧЕННЯ ВІД ВІВО ТА ВІТРО.

ВЛАДИМИР ЕССАУ МАРТОНЕЗ БЕЛЛО

UNIVERSITAT DE VALÈNCIA Publication Service 2011

Докторська дисертація Aquesta буде представлена ​​у Валенсії 5 травня 2011 року відповідно до формату суду відповідно до: -

Доктор Хуан Састре Беллок Доктор Ілва Хеллстен Доктор Хосе Антоніо Лопес Кальбет Доктор Хосеп Антоні Тур Марі Доктор Консуело Борраш Бласко

Режисером буде: д-р Хосе Вінья Рібес д-р Федеріко В. Паллардо Калатаюд д-р Mª Кармен Гомес Кабрера

Legal Dipòsit: V-478-2012 I.S.B.N.: 978-84-370-8203-5 Опублікував: Universitat de València Servei de Publicacions C/Arts Gràfiques, 13 baix 46010 València Іспанія Телефон: (0034) 963864115

Медичний та стоматологічний факультети Кафедра фізіології

МУШУРНО-ГЕМАТОЛОГІЧНІ ЕФЕКТИ ВИКОРИСТАННЯ rHuEpo У КОМБІНАЦІЇ З ФІЗИЧНИМ НАВЧАННЯМ. НАСЛІДКИ ДЕЗМОПРЕССИНУ І ГІПОКСІЇ В ДОПІНГІ КРОВІ. ДО ВИВЧЕННЯ ВІД ВІВО ТА ВІТРО. ДОКТОРСЬКА ТЕЗА Презентація: Володимир Ессау Мартінес Белло Режисер: Професор Д. Хосе Вінья Рібес Професор Д. Федеріко Паллардо Калатаюд Проф. Пані Марі Кармен Гомес Кабрера Валенсія, 2011 р.

Ця докторська дисертація була виконана завдяки фінансуванню, отриманому від наступних проектів:

• Міністерство науки та інновацій (BFU2007-65 803/BFI) • Вища спортивна рада (24/UPB20/07 та 35/UPB20/08) •

Інститут охорони здоров’я імені Карлоса III (ISCIII2006-RED13-027)

• Допомога у навчанні програми докторантських дослідницьких кадрів "V Segles" Модалітат V Segles - компанія. Університет Валенсії. .

Професор Д. Хосе Вінья Рібес, професор кафедри фізіології медичного та стоматологічного факультету університету Валенсії. Професор Д. Федеріко Паллардо Калатаюд, професор кафедри фізіології медичного та стоматологічного факультету університету Валенсії. Професор пані Марі Кармен Гомес Кабрера, професор медичного та стоматологічного факультету Університету Валенсії. СЕРТИФІКАТ: що пан Володимир Ессау Мартінес Белло, професіонал з фізичної культури, спорту та відпочинку з Університету Санто-Томас, Букараманга (титул, затверджений MEC до бакалавра наук з фізичної активності та спорту), здійснював під його керівництвом дана дисертація під назвою: М’язові та гематологічні ефекти використання rhepo в поєднанні з фізичною підготовкою. НАСЛІДКИ ДЕЗМОПРЕССИНУ І ГІПОКСІЇ В ДОПІНГІ КРОВІ. ДО ВИВЧЕННЯ IN VIVO І ВІТРО.

отримати звання доктора.

І для запису для відповідних цілей вони підписують цю сертифікацію. Валенсія, 10 січня 2011 р

Підписано. Професор Д. Хосе Вінья Рібес

Підписано. Федеріко Паллардо Калатаюд

Підписано. Професор пані Марі Кармен Гомес Кабрера

МОЇМ БАТЬКАМ, ЖОЗЕ МАРА І МАРА ЗОРАЙДА

ПОДЯКИ "Не називайте мене іноземцем і не думайте про те, звідки я родом, краще знати, куди ми йдемо, куди нас забирає час". Альберто Кортес.

Я завжди вважав, що вдячність - це найважливіша частина дипломної роботи. І це не виняток. У цьому втілюється, що результат був не лише плодом моєї роботи, але невеликим великим внеском усіх, хто поділився зі мною за ці п’ять років. Ніколи за весь цей час люди та коридори відділення фізіології не змушували мене почувати себе чужою, за це, дякую усім. Зокрема, я хочу подякувати директорам цієї дисертації доктору Хосе Віньї, д-ру Федеріко Паллардо та д-ру Марі Кармен Гомес за те, що вони керували та супроводжували цей навчальний процес. Доктору Вінья, дякую, що ви дали мені можливість стати частиною серйозної команди, відданої пошукам істини. Ясність гіпотез і того, "яке питання я сьогодні задаю природі" - це прекрасний і правильний спосіб навчити досліджувати.

Доктору Паллардо за уважність до співпраці з фінансуванням та адміністративними процедурами моєї стипендії. Підтримка на всіх етапах дисертації була незрівнянною. і

Ви кажете, коли світ почне кінчатися, ми повернемось. Ользі та Сариті міцний поцілунок. Татіс, моя маленька сестричка, ми мали різний, але значний досвід. З другого курсу ви - пильна підтримка сім'ї. Наше життя покращилось за останні роки, зараз все інакше, і це тріумф, все покращується. Я люблю тебе Татіс, і ми там, і ми на правильному шляху. Для Рауля я думаю покращити різдвяні подарунки, але я вас не дуже запевняю. Обійми. І я хочу подякувати серцем у руці двом дуже важливим людям у моєму житті: моєму папі Хосе Марії та моїй Мамі Марії Зорайді. Ви були архітекторами, що ця мрія, мрія стати лікарем збувається. Ця мрія стала можливою завдяки дисципліні, звичкам, відданості, відповідальності та постійному пошуку прихильності, щоб завжди робити те, що хочуть і що мені подобається, але перш за все завдяки тому, що створив і структурував у мені життєвий проект. Сьогодні найважливіший день у моєму житті, і ви двоє наодинці, як коли ви починали з нуля, ви це зробили. Я люблю тебе, обійми ламають кістки, і ми любимо одне одного.

ЗАГАЛЬНИЙ ПОКАЗНИК I. Вступ ……………………………. 1-86 1. Фізіологічна роль еритропоетину ………… 1-10 1.1 Ген еритропоетину …………………………… .1 1. 2. Роль Епо в нееритроїдних клітинах …………… . 4 1.3. Біологічна дія Епо в скелетних м’язах …………………………………………. 5 1.4. Введення рекомбінантного еритропоетину (rHuEpo) та збільшення пропускної здатності кисню …………………………………………… .7 1.5. Лікування rHuEpo, підвищення гематокриту та в’язкості крові ……………………………… 8 2. Регулювання біогенезу мітохондрій у скелетних м’язах …………………………… 11-20 2.1 PGC -1α: Коактиватор 1α рецептора γ, активований проліферацією пероксисом ……… . ……………… .12 2.2 PGC-1α та його роль у регуляції антиоксидантного захисту …………………… ……… ……………… 13 2.3 Ядерний дихальний фактор 1 (NRF-1) ……………… 16 2.4 Мітохондріальний фактор транскрипції А. Експресія мітохондріальної ДНК …………………………………. 17 2.5 Цитохром С …………………………………………… 19

3. Міогенні регуляторні фактори ……………. 20-21 4. Гіпоксія ……………………………………………. 22–42 4.1 Визначення ……………………………………………… 22 4.2 Індукований гіпоксією фактор: HIF-1 ………………… .23 4.2.1 Гени, регульовані у відповідь на зменшення доступного кисню …………………………… .25 4.2.2 Піруватдегідрогеназа кіназа 1 (PDK-1)… 27 4.3 PGC-1α та HIF-1α ……………………………………… .28 4.4 Гіпоксія та фізичні вправи …………………………… . 29 4.4.1 Гіпоксія та гематологічні адаптації у гризунів ………………………………………… 29 4.4.2 Використання висотних систем у спорті. Гіпоксія, спрямована на поліпшення фізичної працездатності …………………………………………… .30 5. Використання речовин та методів, заборонених Всесвітньою антидопінговою агенцією (ВАДА) ………. 43-55 5.1 Перелік речовин та методів, які заборонені у спорті ………………………………………………… 43 5.2 Світова антидопінгова система та боротьба з допінгом крові ………… ………………………… .44 5.2.1 Прямі та непрямі методи виявлення допінгу крові ……………………………… 45 5.2.2 Біологічний паспорт ……………… ………… .48 5.2.3 Розширювачі об’єму плазми ………… .51 5.2.4La

6. Вільні радикали …………………………………. 56–70 6.1 Поняття вільних радикалів …………………………… .56 6.2 Класи вільних радикалів ………… ………………… 57 6.3 Походження АФК …………………………………. 58 6.3.1 Екзогенні джерела ………………………………. 59 6.3.2 Ендогенні джерела. 60 6.3.2.1

мітохондріальний ………………………………. 60 6.3.2.2 Реакція Фентона-Габера-Вейса ………… 64 6.4 Окислювальний стрес. ………………………. 66 6.4.1 Поняття окисного стресу …………………… .66 6.4.2 Окислювальний стрес та пошкодження біомолекул ………. 66 6.4.2.1 Окислювальне пошкодження ліпідів ……………………… 67 6.4.2.2 Окисне пошкодження білків …………………. 69 6.4.2.3 Окислювальне пошкодження ДНК ……………………… .70 7. Антиоксиданти ……………………………………… .71-86 7.1 Поняття антиоксиданту ……… ………………… .71 7.2 Ферментативні антиоксиданти ………………………… .72 7.2.1 Супероксиддисмутаза ………………………… .72 7.2.2 Глутатіонпероксидаза …… ……………………… .73 7.2.3 Каталаза ………………………………………… .74 7.3 Гіпоксія та окислювальний стрес …………………………. .75 7.3.1

збільшення виробництва вільних радикалів щодо гіпоксії ………………………………… .76 7.3.1.1 Фізичні вправи. 76

7.3.1.2 Ультрафіолетові промені ………… . ……………… .76 7.3.1.3 Відсутність антиоксидантної дієти …………… .77 7.3.1.4 Ендогенні джерела утворення радикалів

гіпоксія ……………………………………… 77 7.3.1.4.1 Мітохондрії ……………………………. 77 7.3.1.4.2 Ішемія - явище реперфузії ... 78 7.3.1.4.3 Ксантиноксидаза ………………………. 79 7.4 Вплив впливу гіпоксії на різні маркери окисного пошкодження ……………………… .80 7.4.1 Дослідження на тваринах ………………………………… 80 7.4.2 Дослідження на людях ……………………… .82

II. Цілі…. 87-88 III. Матеріали і методи. ……… .89-135 1. Матеріали …………………………… .89-114 1.1. Дослідження на експериментальних тваринах .................. 90 1.1.1. Дослідження впливу лікування rHuEpo на різні м’язові та гематологічні пристосування у експериментальних тварин ……………………… .90 1.1.1.1 Експериментальні тварини ………… .90 1.1.1.2

лікування rHuEpo ……… 90 1.1.1.3

кров та тканини ……………… .91

1.1.2 Дослідження впливу протоколу гіпоксії

м’язова та фізична працездатність експериментальних тварин ……………………………… 92 1.1.2.1 Експериментальні тварини ……………. 92 1.1.2.2 Протокол

нормобаричний ………………………………… .93 1.1.2.3 Дослідження впливу анаеробних тренувань

аеробіка. 93 1.1.2.4 Видобуток

тканини ………………………………………… 94 1.1.2.5 Забій тварин ………………… .95 1.1.3 Дослідження впливу двох обробок rHuEpo та нормобаричного протокол з періодичною гіпоксією,

експерименти ……………………………… .96 1.1.3.1 Дослідні тварини. 96 1.1.3.2 Протокол

нормобаричне та rHuEpo лікування. 1.1.4 Дослідження впливу протоколу гіпоксії

гематологічні показники після

введення rHuEpo піддослідним тваринам ………………………………… 97 1.1.4.1 Дослідні тварини …………… 97 1.1.4.2 Протокол лікування

Зразки крові ……………………. 99

Забій тварин ……………. 101

1.2 Дослідження на людях. 101 1.2.1 Вивчення ефекту від лікування десмопресином

допінг крові …………………………… .101 1.2.1.1 Людина…. 101 1.2.1.2 Проектування експерименту ……………………… .102 1.3 Дослідження in vitro. Роль активних форм кисню та PGC-1α у регуляції шляхом скорочення індукції MnSOD у скелетних м’язах миші …………………………………………… .104 1.3.1 Миші …………… …………………………… .104 1.3.2 Виділення та первинна культура клітин м’язових м’язів. 105 1.3.3

Протокол електростимуляції ……. 106

Протокол гострої електростимуляції за наявності або відсутності антиоксидантів ... .106

Повторний протокол електростимуляції за наявності або відсутності антиоксидантів… .107

2. Методи. 114-135 2.1 Протокол визначення максимальної аеробної ємності у щурів …………………. ………………… .114 2.2 Визначення еритропоетину …………………… .115 2.2.1 Обґрунтування… …………………………………… .115 2.2.2 Підготовка зразка ……………………… .116 2.2.3 Процедури та розрахунки ………………………. .116 2.3 Визначення гемоглобіну, гематокриту та% ретикулоцитів …………………………………………… .117 2.4 Визначення

еритроцити. 117 2.5 Визначення креатиніну, альбуміну, загальних білків та глюкози ……………………………………… 118 2.6 Екстракція білків із м’язової тканини 118 2.6.1 Обґрунтування ………………… ……… …………… .118 2.6.2 Протокол ………………………………………. 119 2.6.3 Кількісна оцінка ……………………………………… 120 2.7 Метод

білки: метод Лоурі ………………………… 120 2.7.1 Обґрунтування ……………………………………… .120 2.7.2 Реагенти …………………… …… ………………. 121 2.7.3 Процедура ……………………………………. 121

2.7.4 Розрахунки …………………………………………… .121 2.8 Електрофорез

(PAGE-SDS) та подальший вестерн-блотинг ………… 122 2.8.1 Обґрунтування ……………………………………… .122 2.8.2 Гель та умови перенесення ……………. 123 2.8.3 Візуалізація ……………………………………… .124 2.9 Визначення активності цитратсинтази (ЄС 2.3.3.1). 126 2.9.1 Реагенти …………………………………………. 126 2.9.2 Процедура гомогенізації ……………. 127 2.9.3 Вимірювання активності ………………………… .127 2.9.4 Розрахунки …………………………………………… .128 2.10 Виділення РНК із скелетних м’язів миші клітини ……………………………… .128 2.10.1 Порядок ……………………………………. 129 2.10.2 Кількісне визначення концентрації РНК …… .129 2.10.3 Синтез кДНК: Ретротранскрипція (RT) …… .130 2.10.4 Кількісна ампліфікація РНК (RT-PCR у реальному часі) ……………… …………… …………… 131 2.11 Позаклітинне визначення активних форм кисню

IV. Результати… . ……………………. 136–187 1. Дослідження ефекту від лікування rHuEpo протягом двох тижнів у різних

експерименти ... 136-149 1.1 Гематологічні адаптації у експериментальних тварин ………………………………… 137 1.2 Експресія білків, пов’язаних з біогенезом мітохондрій у скелетних м’язах щурів ……………………………… ……… …… .141 1.2.1 Вплив лікування rHuEpo протягом двох тижнів на експресію PGC-1α, NRF1 та mTFA в м’язі підошви щура ………… 142 1.2.2 Вплив лікування rHuEpo протягом двох тижнів у експресія цитохрому С у підошві щура ………………………… 143 1.3 Експресія фактора росту судинного ендотелію в скелетних м’язах щурів… .144 1.4 Експресія міогенних регуляторних факторів у скелетних м’язах щурів ……………… … .146 1.4.1 Вплив лікування rHuEpo протягом двох тижнів на експресію MyoD та Myf5 у

1.5 Максимальна аеробна швидкість у експериментальних тварин. 148

2. Вивчення ефекту нормобаричного протоколу з інтермітуючою гіпоксією, у поєднанні

анаеробні, за різними гематологічними показниками, працездатність

експериментування. 149-163 2.1 Гематологічні адаптації у експериментальних тварин ………………………………… 150 2.2 Адаптації

експериментальні тварини ………………… .153 2.2.1 Експресія PDK-1 у червоних м’язах шлунково-кишкового тракту ………………………………… .154 2.2.2 Індукція захисного ферментативного антиоксиданту та білки на реакцію на стрес у експериментальних тварин ……………… .155 2.2.2.1

щурячий червоний гастрокнеміус. 156 2.2.2.2

гастрокнеміус червоних і білих щурів ……… 157 2.2.3 Індукція білків, пов’язаних із процесом біогенезу мітохондрій …………… 159 2.2.3.1 Експресія

червоно-білий щурячий гастрокнеміус ……. 159 2.2.3.2 Експресія цитохрому С у м’язах щурів …………………………………………. 160 2.2.3.3 Активність

фермент цитрат синтази в

червоний м’яз щурячого гастрокнемія ……… 162 2.2.4 Максимальна аеробна швидкість…. 163

3. Порівняльне дослідження ефекту двох методів лікування rHuEpo (300 МО та 500 МО) проти протоколу періодичної гіпоксії

різні гематологічні пристосування у експериментальних тварин .... 164-167 3.1 Гематологічні адаптації з різними методами лікування ……………. ……………………… .165

4. Вивчення впливу протоколу нормобаричної інтермітуючої гіпоксії на різні

після введення rHuEpo у експериментальних тварин .... 168-175 4.1 Гематологічні пристосування у експериментальних тварин ............... 169 4.2 Рівні

стимуляція еритроцитів (OFF-Hr оцінка) після введення rHuEpo …………………… .173

5. Вивчення впливу лікування десмопресином (DDAVP) на гематологічні показники, які звикли

кров ……………………. 176-181 5.1 Вплив введення DDAVP на гематологічні змінні, що контролюються антидопінговими органами… . ………………… .177 5.2 Вплив лікування DDAVP на концентрацію

загальний вміст білків, креатиніну та глюкози …… .179

6. Дослідження in vitro. Роль активних форм кисню та PGC-1α у регулюванні

індукція MnSOD у скелетних м’язах миші …………… 182-187 6.1 Вплив електричної стимуляції на позаклітинне окислення DCFH ………………. 182 6.2 Ефект

антиоксидантна обробка, у експресії PGC1α та MnSOD ……………………………………. 184 6.3 Вплив багаторазової електростимуляції та антиоксидантної обробки на рівень експресії MnSOD на рівні білка ………………………… .186

V. Обговорення. 188-234 Обґрунтування дослідження …………………… .188 1. Вивчення ефекту від лікування rHuEpo

м’язові та гематологічні у експериментальних тварин ………………… .192-202 2. Вивчення ефекту протоколу гіпоксії