предметів
реферат
Для цього дослідження ми використали нашу встановлену парадигму PAS (з процедурою нюхового кондиціонування) для з’ясування модулюючого ефекту сигналізації рецептора CB1 при обробці гедонічного винагороди. Оскільки PAS до цього часу оцінювали лише на щурах, іншою метою цього дослідження було визначення та підтвердження парадигми у лабораторних мишей. Вплив природних подразників та зловживання наркотиками призводить до нейропластичних змін, пов'язаних із винагородою, в областях мозку, і нещодавно ми показали, що гостра поява смакового нюхового подразника у щурів стимулює негайний ранній ген c-Fos в смугових областях (Friemel et al., 2010). У цьому дослідженні ми прагнули розширити наші висновки, щоб вивчити участь інших факторів транскрипції. Щоб дослідити потенційні відмінності в обробці нейрональних винагород у мишей WT та KO, ми додатково вивчили здатність умовного запаху стимулювати експресію смугастого FosB/AFosB.
ПРЕДМЕТИ І МЕТОДИ
предметів
Всього для цього дослідження було використано 132 тварини. Самці дорослих щурів Wistar були придбані у лабораторії Wistar Harlan Laboratories (AN Venray, Нідерланди). Самці дорослих мишей дикого типу (WT) та CB1 з вибиванням рецепторів (CB1 KO) з генетичним походженням C57BL/6J, виведені в Боннському університеті (Zimmer et al, 1999), були перевезені до Мангейма (Німеччина). Тваринам було дозволено оговтатися від транспортування і вони звикли до нового середовища принаймні протягом 7 днів після прибуття. Усі тварини, які використовувались у цих експериментах, відповідали віковій категорії (щури: 4 місяці; миші: 2-3 місяці). Мишей розміщували індивідуально, щоб уникнути перукарні та агресивної поведінки в клітинах Макролона (євростандарт II типу), а щурів поселили групами по чотири особи (євростандарт IV) в кімнаті для тварин у 12-годинній колонії світло-темно (світло о 07:00) - 1900 годин). Тварини отримали вільний доступ до води та стандартних лабораторних кормів протягом першого тижня після прибуття і підтримували приблизно 95-97% маси їх тіла під час поведінкових тестів, коли забезпечували висококалорійне підсолоджене згущене молоко.
Усі експерименти проводились відповідно до Посібника з догляду та використання лабораторних тварин, затвердженого та оголошеного Національним інститутом охорони здоров’я та затвердженого місцевим комітетом з догляду за тваринами (Карлсруе, Німеччина).
Експериментальний дизайн
У першому експерименті ми досліджували вплив антагоніста/зворотного агоніста рецептора CB1 SR141716 (SR; римонабант) та синтетичного агоніста рецепторів канабіноїдів WIN 55 212-2 (WIN) на добре встановлену процедуру PAS у щурів. Отже, щури отримували одноразову ін'єкцію 1 мг/кг SR/транспортний засіб або 0,3 мг/кг WIN/транспортний засіб під час тренування (експеримент SR: SR n = 16, транспортний засіб n = 12; експеримент WIN: WIN n = 9, транспортний засіб n = 12 ). Як добре відомо, що перша ін’єкція канабіноїдних агоністів попередньо необробленим гризунами лікарських засобів може сприйматися як аверсивна (Schneider and Koch, 2002; Chaperon and Thiebot, 1999), крім того, тваринам в експерименті WIN робили одну первинну ін’єкцію . 0,3 мг/кг WIN, за 48 годин до початку тренувальної процедури PAS. Щоб виключити, що хронічне введення SR/WIN може вплинути на амплітуду ASR як такої, ми додатково оцінили ASR в іншій когорті тварин, які не пройшли навчання за винагородою. Цих тварин також двічі тестували на ASR: один раз до і один раз після хронічного введення препаратів WIN/SR або відповідного носія (експеримент WIN: WIN n = 6, носій: n = 9; експеримент SR: SR n = 6, носій: n = 7).
Наступні експерименти проводили на мишах CB1 KO та їх відповідних однолітках WT. Перша когорта мишей WT/KO була використана для перевірки поведінки. Групу I тестували на споживання підсолодженого згущеного молока (SCM), PAS та роль переваги запаху (WT та CB1 KO: n = 11). Між поведінковими тестами тварин залишали безперешкодними протягом 3 - 4 днів. Група II тренувалася помилково і служила контролем під час тестування PAS (WT та CB1 KO: n = 7). Друга когорта мишей була використана для експерименту FosB/AFosB (WT: треновані та макетні: n = 5; CB1 KO: треновані n = 4, імітоване тренування n = 5).
Пляшка SCM (Nestle AG, Франкфурт, Німеччина; розведена 1: 3 водопровідною водою) використовувалася для всіх поведінкових експериментів як нагорода за їжу. Усі тварини були привчені до СКМ у своїй домашній клітці протягом 24 годин принаймні за 4 дні до початку поведінкових тестів чи тренувань, щоб уникнути неуваги до винагороди, спричиненої новизною.
наркотики
SR (як правило, надається NIMH) розчиняють у етанолі та Твін-80, а потім розбавляють фізіологічним розчином (1: 1: 18). WIN (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Німеччина) розчиняли в 0,1% Твін-80 і розбавляли у фізіологічному розчині (0,9%). Обидва препарати вводили внутрішньочеревно в дозі 1 мг/кг (SR) та 0,3 мг/кг (WIN). SR вводили 30 хвилин і WIN безпосередньо перед тренуванням з об'ємом ін'єкції 1 мл/кг.
Тестування поведінки
PAS у щурів
Аналізи PAS проводили в камері сюрпризів (SR-LAB; San Diego Instruments, San Diego, CA), як описано вище (Schneider and Spanagel, 2008; Schneider et al., 2010; Brand et al, 2012). Імпульс білого шуму (40 мс, рівень звукового тиску 100 дБ (SPL)) був використаний як імпульсний стимул для перевірки на переляк. Час акліматизації 5 хвилин, протягом якого щури не отримували стимулу, за винятком фонового шуму (60 дБ), супроводжувався поданням п’яти початкових подразників. Наступний протокол тестування складався з 30 вражених імпульсів з міжвипробувальним інтервалом, хаотично розподіленим між 10 і 20 с. Тести на сюрприз проводили двічі за наявності ознак запаху (апельсин, ефірні олії; Primavera Life, Сульцберг, Німеччина), один раз перед цим (базовий ASR; ASR1) і ще раз через 48 годин після тренінгу з асоціації запахів (ASR2). Запах (30 мкл) подавали в чашку Петрі, яку поміщали в коробку-сюрприз під час звикання. PAS був розрахований як середній відсоток зменшення від базової амплітуди ASR (100- (100x середня амплітуда ASR2/середня амплітуда ASR1 (базовий рівень)).
Навчання з оплати праці тривало 5 днів. Під час кожного щоденного 90-хвилинного тренування щурів розміщували в окремих клітках (євростандарт ІІІ типу) і зазнавали три випадки появи запахів у випадкові моменти часу. Запах (апельсин, 15 мкл) додавали до маленької чашки Петрі, розміщеної в центрі дротяної кришки, на 2 см нижче отвору питної пляшки SCM. Після вільного доступу до нагороди протягом 5 хвилин запах і пляшка були видалені. За тридцять хвилин (експеримент SR) або безпосередньо (експеримент WIN) перед початком кожної тренування всі тварини отримували одну ін’єкцію відповідного препарату або носія.
PAS у мишей CB1 KO і WT
Випробування на мишах не відрізнялися від протоколу, описаного вище для щурів, за винятком інтенсивності стресу (115 дБ SPL). Навчання асоціації у мишей тривало 5 днів і трохи відрізнялося від нашого протоколу щурів. Навчання проводилося в клітинах для домашніх мишей. Протягом 6 годин щодня (від 1000 до 1600 годин) усі миші відчували п’ять подань запаху у випадкові моменти часу. Запах (апельсин, 15 мкл) подавався в невеликій чашці Петрі, розташованій посередині дротяної кришки, на 2 см нижче отвору пляшки. Після вільного доступу до нагороди протягом 5 хвилин запах і пляшка були видалені.
Для перевірки нового протоколу PAS у мишей ще одну групу тестували в змодельованих умовах. Ці тварини пройшли імітаційну тренувальну процедуру, де їм надали доступ до SCM протягом 5 днів щодня протягом 25 хвилин у випадкові моменти часу без супутнього прояву запаху. Вплив запаху проводили в незв’язаному режимі принаймні за 4 години після/до підходу СКМ.
Обмежене поглинання SCM у мишей CB1 KO та WT
Тварин тестували на споживання СКМ у своїй домашній клітці. У день випробування вимірювали масу тіла (БТ) і тварин поміщали назад у свою домашню клітку. Тут їм надали безкоштовний доступ до пляшки SCM протягом 30 хвилин. Потім споживання SCM розраховували як споживання g на кг маси тіла.
Тест на перевага запаху у мишей CB1 KO та WT
Роль переваги запаху у відкритому полі (20 × 20 x 25 см 3) використовували для оцінки здатності виявляти запах у мишей CB1 KO. Під час випробувань на арену помістили дві скляні соляні машини однакової форми (з перфорованими металевими ковпачками), що містять фільтрувальний папір, змочений у 15 мкл води або лимонної олії. Мишей звикали до арени та (нецентральних) суб’єктів протягом 10 хвилин за 24 години до тестування. Щоб перевірити перевагу об'єкта, мишам дозволяли вільно досліджувати ароматизатори протягом 6 хвилин. Тварин було знято на відео, а час (-і) обстеження кожного об’єкта проаналізовано автономним експериментатором, засліпленим до генотипу миші. Для обчислення відсотка розрізнення запаху час обстеження ароматів лимонної трави виражали як відсоток від загального часу обстеження обох об'єктів.
імуногістохімія
Стимуляція FosB/AFosB та підготовка мозку
Для вимірювання експресії білка FosB/AFosB мишей тренували (або макетували, якщо це необхідно) протягом 5 днів, щоб асоціювати запах апельсина з присутністю SCM, як описано вище для навчального протоколу PAS. Всі тварини були піддані впливу оранжевого запаху (15 мкл) протягом 48 годин після останнього тренування протягом 10 хвилин. Тварин приносили в жертву через 90 хвилин шляхом обезголовлення, мозок виймали, заморожували в метилбутані протягом 90 секунд і зберігали при -80 ° C. Заморожений мозок розрізали на кріостати на коронкові зрізи товщиною 12 мм і негайно розморозили на слайдах Superfrost і зберігали ... при -80 ° С. Дві області мозку, пов'язані з винагородою, ядро ядер (NAC) і спинний смугастий кіст (dStr), були обрані як регіони, що представляють інтерес.
Імуногістохімія FosB/AFosB
Слайди розморожували і сушили при кімнатній температурі перед фіксацією в 4% PFA. Слайди промивали у забуференному фосфатом сольовому розчині (PBS) та PBS 0,1% Твін-20 (PBS-T). Через 30 хвилин інкубації з 0,3% H 2 O 2, розчиненим у метанолі, та подальшим промиванням у PBS/PBS-T, первинні моноклональні антитіла до FosB (№ 2251; New England Biolabs GmbH, Франкфурт, Німеччина), які розпізнають як FosB, так і Білки AFosB інкубували у концентрації 1: 400 у PBS з 0,2% нормальної козячої сироватки протягом ночі при 4 ° C. Скла знову промивали у PBS/PBS-T та обробляли набором кролика IgG Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) відповідно до інструкцій виробника. Слайди інкубували з вторинними антитілами протягом 1 години при кімнатній температурі, промивали та обробляли авідином та біотином протягом 1 години при кімнатній температурі. Потім зрізи промивали і імуногістохімічно фарбували діамінобензидином (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі) і переносили в ступінчасту серію розчинів етанолу та ксилолу перед покриттям в Eukitte (O Kindler GmbH, Фрайбург, Німеччина).
Статистичний аналіз
Фармакологічні ефекти WIN та SR на відсоток PAS у дресированих та нетренованих щурів аналізували двостороннім дисперсійним аналізом (ANOVA) відповідно. Вплив генотипу (WT/KO) на поведінкові показники оцінювали за допомогою t-тестів Стьюдента, за винятком часового курсу ASR та PAS у мишей KO та WT. Ці дані, а також поглинання SCM під час навчання PAS в експериментах WIN та SR, були проаналізовані шляхом повторних вимірювань ANOVA з використанням тесту Стьюдента-Неймана-Кельса як пост-хок аналіз. Індукована запахом стимуляція FosB/AFosB в NAC та dStr аналізували для кожного генотипу за допомогою t-тестів Стьюдента. Згідно з нашими попередніми висновками щодо стимуляції c-Fos (Friemel et al, 2010), ми очікували спостерігати підвищену експресію FosB/AFosB після тренування запаху у тварин із ЗТ. З цієї причини для аналізу даних на WT-мишах застосовували односторонні t-тести. Усі дані виражаються як середнє значення ± SEM. Рівень статистичної значущості визначали як p 
Приємне ослаблене полегшення (PAS), акустична реакція на здивування (ASR) та споживання підсолодженого згущеного молока (SCM) у мишей, що нокаутують CB1 (KO) та дикого типу (WT). Ми спостерігали стабільну реакцію PAS у мишей WT; однак у мишей CB1 KO виявлено, що PAS майже відсутній (a). Щоб контролювати можливі варіації здивованої звички між тестовими сесіями, другу когорту мишей KO та WT піддавали змодельованій процедурі навчання без запаху та тестували згідно з протоколом PAS. Жодних відмінностей між генотипами не спостерігалося, що свідчить про подібне повторення ASR після повторного тестування на тваринах CB1 KO та WT (b). Табір умовного запаху послаблював величину ASR у тварин WT під час другого спуску (c), тоді як у мишей CB1 KO (d) такого зменшення не спостерігалося. Часовий курс у відсотках PAS був значно нижчим у мишей CB1 KO протягом тестування (e). Нарешті, вільне поглинання SCM було зменшено у мишей CB1 KO порівняно з контролем WT (f). Дані виражаються як середнє значення ± SEM (стор
Перевага запаху у нокауту CB1 (KO) та мишей дикого типу (WT). Обидва генотипи продемонстрували подібну перевагу до запашного предмета під час тестування на виявлення запаху, вказуючи на порівнянне сприйняття запаху у тварин CB1 KO та WT. Дані виражаються як середнє значення ± SEM (WT та CB1 KO: n = 11).
Повнорозмірне зображення
- Завантажте слайд PowerPoint
Стимуляція FosB/AFosB, спричинена запахом, у мишей CB1 KO та WT
Зразкове фарбування FosB/AFosB dStr у тварин із обох генотипів, контрольованих неприємним запахом та імітацією, показано на малюнку 4. Індукція експресії FosB/AFosB запахом таборів була значно вищою у мишей WT, які проходили тренінги з нагородження. у мишей з імітованим тренуванням у NAC (t 8 = -1, 99, p = 0,04) (рис. 5а) та dStr (t8 = -1, 91, p = 0,047) (рис. 5b). Однак такої різниці не спостерігалося у мишей CB1 KO (NAC: t7 = 0,88, p = 0,41; dStr: t7 = -0,21, p = 0,84) (рис. 5c і d), що вказує на те, що гострий запах, пов'язаний з виплатою винагороди, не призводять до значного стимулювання ділянок мозку, пов'язаних із винагородою, у дресированих тварин CB1 KO.
Місця для відбору проб з використанням смуг та зразкове фарбування FosB/AFosB. Схема коронального мозку ілюструє стабільне положення гранул для відбору проб (500 × 500 мкм 2) для спинного смугастого тіла (dStr) та ядерного накопичення (NAC) у площині перерізу, що відповідає +1, 45 до +1, 35 від Брегма. Репрезентативне фарбування FosB/AFosB dStr від мишей із імітованим запахом та запахом обох генотипів показано праворуч.
Повнорозмірне зображення
- Завантажте слайд PowerPoint
Стимуляція FosB/AFosB шляхом виявлення запаху апетиту у мишей, що нокаутують CB1 (KO) та дикого типу (WT). Встановлено, що умовна мітка запаху значно підвищує експресію FosB/AFosB у дресированих тварин із ЗТ у ядрі акуменсу (NAC) (a) та спинному смугастому тілі (dStr) (b) порівняно з контрольованими підробленими. Жодної такої підвищеної експресії не спостерігалося для мишей CB1 KO ні в NAC (c), ні в dStr (d). Дані виражаються як середнє значення ± SEM (стор