клітини

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Добова регуляція системи грелін-КОЗ у мишей
  • Добова регуляція системи грелін-ГОАТ у клітинній лінії греліноми миші
  • обговорення
  • методи
  • звір
  • Розробка експерименту: циркадна регуляція греліну у мишей WT та Bmal1-KO
  • Культура клітин, експерименти з сироватковим шоком та стимуляцією
  • Експерименти з низькою РНК-інтерференцією
  • Грелін РІА
  • Кількісна ПЛР в режимі реального часу
  • імуногістохімія
  • Статистичний аналіз
  • Детальніше
  • Коментарі

предметів

реферат

Грелін, 28-амінокислотний кишковий пептид, був ідентифікований в 1999 році як ендогенний ліганд рецептора секретагогу гормону росту типу 1А. Повідомляється, що посттрансляційне октаноїлювання гереліну до серину-3, каталізоване ферментом грелін-О-ацилтрансфераза (GOAT), є важливим для його біологічної активності 2, 3. Тим не менше, октаноїл-грелін становить лише близько 10% від усього циркулюючого греліну, тоді як решта 90% - не ацильований 4. Протягом наступних років після відкриття було показано, що грелін не тільки опосередковує вивільнення гормону росту, але й контролює інші основні фізіологічні функції. Грелін збільшує споживання їжі, стимулюючи вивільнення орексигенних нейропептидів, пов'язаного з гуті пептиду (AgRP) та нейропептиду Y (NPY) з ядра гіпоталамусової дуги 5, і тому вважається фізіологічним ініціатором їжі. Крім того, він надає стимулюючу дію на ожиріння та моторику шлунка та є важливим посередником гомеостазу глюкози 6, 7. Інші фізіологічні функції греліну включають модуляцію проліферації клітин, імунну систему, гомеостаз хрящів і кісток, сон, пам’ять та поведінкові ефекти.

Завдяки спільній дії декількох медіаторів, рівень греліну в плазмі крові постійно коливається протягом дня. Поживний статус є першим і добре задокументованим регулятором викиду ендогенного греліну. У гризунів рівень греліну в циркуляції збільшується голодом 8, 9 і пригнічується багаторазовим дозуванням 9. Подібним чином рівень греліну в плазмі крові зростає у здорових добровольців приблизно за годину до регулярного прийому їжі, а потім різко падає 10. Індуковане голодуванням рівень вмісту греліну в плазмі залежить від холінергічного та адренергічного відділів вегетативної нервової системи 11, 12, 13, тоді як пригнічення рівня греліну після їжі опосередковується калорійністю та типом поживних речовин 14, 15, хоча і не повністю Вважається, що зондування поживних речовин переважно опосередковується активацією різних рецепторів смаку, присутніх на ентероендокринних клітинах, включаючи клітини греліну шлунка 16, 17, 18, 19 .

Метою цього дослідження було дослідити важливість функції генів для годинників у циркадному ритмі експресії та секреції греліну. Спочатку ми дослідили вплив генетичної делеції гена ядерного годинника Bmal1 на 24-годинні коливання рівнів греліну в плазмі та шлунку та експресію GOAT у мишей. По-друге, ми досліджували можливість того, що клітини, що секретують грелін, могли діяти як FEO, вивчаючи наслідки голодування або підказки як пускових механізмів циркадної ритмічності в клітинній лінії греліноми.

результат

Добова регуляція системи грелін-КОЗ у мишей

Миші WT виявляли типову нічну поведінку і споживали більшу частину їжі протягом темного циклу (рис. 1а). Споживання їжі починало зростати з Zeitgeber (ZT) 8 разів і досягло найвищих рівнів, що визначають акрофаз ритму, на ZT 21. Оскільки споживання їжі стимулюється вивільненням орексигенного пептиду (AgRP), пов'язаного з агуті, ми визначали рівні експресії мРНК гіпоталамусової мРНК цього нейропептиду. Акрофаза (ZT 21) добового ритму експресії мРНК AgRP (період 23 години, P

( a ) Споживання їжі, ( b ) гіпоталамусні відносні рівні експресії мРНК AgRP, ( c ) рівні октаноїлгреліну в плазмі та ( d ) загальний рівень греліну в плазмі крові у мишей WT або Bmal1-KO ad libitum. ( e, f ) Відносні рівні експресії греліну ( e ) та КОЗА ( f ) мРНК у шлунку мишей WT або Bmal1-KO (n = 7-8 мишей/момент часу/генотип). Світла і темна фази затінені білим і сірим. (AU = будь-яка одиниця).

Повнорозмірне зображення

У WT-мишей рівні октаноїлгреліну в плазмі коливалися циркадно (період 23 години; P

( a - f ) Репрезентативні ділянки зрізів корпусу, забарвлені на октаноїл-грелін у мишей WT ( а - в ) або Bmal1-KO ( d - f ) у ZT 8 ( a, d ), ZT 12 ( б, е ) та ZT 20 ( c, f ). g ) Зображення розділу негативного контролю без первинних антитіл. ( h ) Кількість клітин, імунореактивних на октаноїл грелін/мм2 і ( i ) інтенсивність фарбування октаноїловим греліном у частинах корпусу мишей WT або Bmal1-KO (n = 3 миші/час/генотип) Світла і темна фази затінені білим і сірим. (AU = будь-яка одиниця).

Повнорозмірне зображення

Циркадіанні коливання рівнів експресії греліну в шлунковій мРНК спостерігалися також у мишей WT (20-годинний період, Р 29 індукував стійкі коливання в транскрипційному накопиченні мРНК усіх генів годинників, крім годинників (рис. 3).

Відносний рівень експресії мРНК ( a ) Bmal1, ( b ) Годинник, ( c ) Cry1 і Cry2, ( d ) Per1 та Per2, ( e ) Per3 a ( f ) Rev-erb-α у клітинах гриліноми MGN3-1 у відповідь на синхронізацію сироваткового шоку. (AU = будь-яка одиниця).

Повнорозмірне зображення

Далі ми дослідили, чи відповідає секреція греліну циркадному ритму у відповідь на стимуляцію сполуками, які опосередковують виділення греліну або натщесерце (L-адреналін), або в стані насичення (пептон, суміш амінокислот та пептидів). Для цього шокові клітини сироватки інкубували з цими сполуками кожні 4 години протягом 3 годин. Базальна секреція октаноїлового греліну (лікування носієм) не виявляла циркадного ритму на відміну від загальної секреції греліну (26-годинний період, P

У цьому дослідженні ми першими продемонстрували, що генетична делеція гена Bmal1 годинникового ядра не тільки усуває циркадний ритм сигналізації греліну і, отже, циркадний ритм прийому їжі, але також послаблює абсолютну продукцію греліну та КОЗИ мРНК. Крім того, ми надаємо переконливі докази того, що за відсутності головного годинника, пов’язані з їжею сигнали можуть вводити молекулярний годинник у шлункову клітину, що секретує грелін, і регулювати ритмічну секрецію греліну. Крім того, диференціальні реакції на октаноїл і загальний вихід греліну в пептон з їжею, разом з ритмічною експресією GOAT, але не мРНК греліну в клітинах греліноми, свідчать про те, що клітина греліну, така як FEO, не тільки регулює циркадний ритм греліну, але, можливо, навіть більше головне від GOAT.

Наше дослідження in vivo на мишах WT підтверджує попередні спостереження, що рівні греліну в плазмі коливаються циркадно і досягають максимальних рівнів під час неактивної фази тіла 20, 21, 22, 23. Збільшення накопичення греліну та мРНК GOAT в ZT4 дозволяє припустити, що циркадна система передбачала вивільнення греліну в ZT 8, імовірно, спричиняючи ритмічність цих генів через елементи E-box у їх промоторних областях 31. Кількість імунореактивних клітин залишалася незмінною протягом 24 годин, що свідчить про те, що зазвичай всі клітини греліну шлунка також сприяють секреції цього пептиду. Крім того, інтенсивність фарбування греліну спостерігалася в антифазі з рівнем греліну в плазмі, що підкреслює, що шлунок служить основним джерелом циркулюючого греліну 32, 33, 34 .

Незважаючи на тенденцію до збільшення калорійності, миші Bmal1-KO демонстрували значно нижчу масу тіла порівняно з контролем WT. Кілька досліджень підкреслювали, що видалення генів циркадних годин у мишей може різко змінити масу тіла та склад тіла 37, 38, 39, 40. Повідомляється, що Bmal1 відіграє вирішальну роль у контролі адипогенезу та ліпідного обміну 41, 42. Зниження ємності накопичення жиру у мишей Bmal1-KO може пояснити, чому збільшення споживання їжі не супроводжувалося збільшенням маси тіла.

Цікаво, що на відміну від нашого дослідження in vivo, експресія мРНК греліну в клітинах MGN3-1 коливалась цілодобово, припускаючи, що зовнішній вхід потрібен для ритму, який спостерігається на рівні мРНК греліну in vivo. На відміну від греліну, експресія мРНК GOAT у культивованих клітинах показала циркадний малюнок, що свідчить про те, що ритм цього ферменту регулюється незалежно від головного годинника.

Інтерпретація результатів ускладнювалася спостереженням, що характер загальної секреції греліну у відповідь на використані подразники не завжди відповідав закономірності октаноїлового греліну. Хоча буфер HEPES не викликав ритму секреції октаноїлового греліну, він виявляв загальну секрецію греліну. Навпаки, для пептону спостерігалося зворотне, ритмічність виявлялася в октаноїлі, але не в загальній секреції греліну. Крім того, L-адреналін зміг викликати ритмічність в обох формах греліну. Ці відмінності не супроводжувались змінами в моделях експресії мРНК греліну або GOAT. Однак ми не можемо виключити, що ці симптоми годування або голодування спричинили зміни на рівні білка або вплинули на активність ферменту GOAT. Подальші дослідження повинні додатково дослідити, чи циркадний контроль сигналізації греліну дійсно може бути опосередкований різницею в часі в активності або рівнях білка цього унікального октаноїлуючого ферменту.

У сукупності ці результати дозволяють припустити, що молекулярні годинники в секретуючих грелін клітинах шлунку регулюють не тільки грелін, а й активність КОЗ у відповідь на різні подразники, пов’язані з їжею. Далі вони припускають, що регуляція секреції греліну є навіть більш складною, ніж спочатку вважалося, як натщесерце, так і після їжі. Подальші дослідження необхідні для подальшого визначення основних механізмів.

Трансфекція клітин греліноми специфічною для Bmal1 siРНК не змінила секреторну реакцію клітин, що секретують грелін, на пептон або L-адреналін. З огляду на те, що обидва подразники змогли викликати циркадний малюнок у секреторній відповіді клітин MGN3-1 і що мишам Bmal1-KO не вистачало циркадних ритмів у виділенні греліну, це було скоріше неінтуїтивною знахідкою. Однак опосередкований міРНК нокдаун Bmal1 може бути придушений сироватковим шоком. Високі концентрації в сироватці крові, необхідні для синхронізації клітинних цілодобових годин, можуть стимулювати ріст і поділ клітин, тим самим перешкоджаючи процесу нокдауну. З іншого боку, нещодавні дослідження показують, що годинникова мережа використовує активні механізми компенсації, а не просту надмірність, щоб функціонувати як генетична балансуюча система, щоб підтримувати функцію годинника, коли стикаються з генетичними та екологічними порушеннями 52, 53. Тому на збивання Bmal1 можуть впливати інші компоненти циркадної системи, забезпечуючи опір молекулярного годинника.

На закінчення це дослідження наголошує на важливості гена ядерного годинника Bmal1 у циркадному ритмі греліну, а отже, і в циркадному ритмі споживання їжі. Висновок про те, що шлункова клітина, що секретує грелін, виявляє ендогенну циркадну секреторну реакцію на підказки, пов'язані з їжею, підкреслює важливість часу споживання їжі для визначення вивільнення греліну. Крім того, оскільки циркадна система також контролює передачу сигналів греліну через октаноїлуючий фермент GOAT, ці результати підкреслюють необхідність подальшої характеристики ролі цього унікального ферменту та розвитку фармакологічних модуляторів активності GOAT.

методи

Розмноження пар мишей, гетерозиготних для Bmal1, люб’язно надав Р. Лійнен (KU Leuven, Leuven, Бельгія). Усі миші KO та їх посліди WT були розміщені в приміщенні для тварин у Левені KU та генотиповані за допомогою ПЛР-аналізу, проведеного на загальній геномній ДНК хвоста. Мишей утримували в середовищі з контрольованою температурою (20-22 ° C) на циклі 12 год/12 год год світло/темно (де ZT 0 - звичайний вимикач світла) і мали доступ за умови вільного доступу до їжі та питної води. Всі експерименти були схвалені Комітетом з етики для експериментів на тваринах в КУ Левен і проводились відповідно до затверджених рекомендацій.

Розробка експерименту: циркадна регуляція греліну у мишей WT та Bmal1-KO

Мишей WT та Bmal1-KO (50% самців та 50% жінок) у віці від 12 до 16 тижнів приносили в жертву протягом 24 годин з інтервалом у 4 години. Кров відбирали шляхом серцевої пункції та обробляли для визначення греліну. Гіпоталамус збирали, зберігали в РНК-пізніше (Qiagen, Hilden, Німеччина) та обробляли для ПЛР у реальному часі. Шлунок розкривали вздовж більшої кривої. Смужку розрізали вертикально зверху вниз в середину шлунка, зберігали в РНК-пізніше і обробляли для ПЛР у реальному часі. Ліву частину шлунку негайно зафіксували для імуногістохімії.

Культура клітин, експерименти з сироватковим шоком та стимуляцією

Клітини MGN3-1 54 греліноми культивували в DMEM з доповненням 10% плодової бичачої сироватки (FBS) та сумішшю 1% пеніциліну (100 Од/мл) та стрептоміцину (100 мг/мл) (P/S) при 37 ° C при 5 ° C.% CO 2. Клітини синхронізували, використовуючи наступну процедуру сироваткового шоку. Через добу після щеплення середовище замінили на безсироваткову DMEM. Через 12 годин це середовище замінювали насиченим сироваткою середовищем (DMEM + P/S, доповненим 50% кінської сироватки) протягом 2 годин. Потім клітини висівали на DMEM + 2% FBS до часу стимуляції. У шість різних часових точок протягом 24 годин синхронізовані клітини інкубували протягом 3 годин у носії (буфер HEPES), 3% пептону (ферментативне розщеплення казеїну, Sigma (Сент-Луїс, Міссурі, США) або 5 мкМ L -адреїну (Sigma Супернатант клітин обробляли на радіоімуноаналіз на грелін (RIA), як описано нижче, і клітини обробляли для ПЛР у реальному часі.

Експерименти з низькою РНК-інтерференцією

Суміш чотирьох заздалегідь розроблених siРНК, націлених на послідовність Bmal1, була придбана у GE Healthcare. Суміш чотирьох конструкцій siRNA, призначених для націлювання на будь-які відомі гени у людини, миші чи щура (нецільова група siRNA, GE Healthcare), використовувалася як негативна контрольна siRNA для виявлення побічних ефектів. Трансфекцію клітин сірої греліноми (25 нМ) проводили інтерфероном (трансфекція Polyplus). Через 48 годин клітини піддавали синхронізації сироваткового шоку (як описано вище) і поміщали на DMEM + 2% FBS на 16 годин. Потім синхронізовані клітини інкубували протягом 3 годин у носії (буфер HEPES), 3% пептоні або 5 мкМ L-адреналіну. Ефективність трансфекції визначали методом ПЛР у режимі реального часу. Надосадову рідину клітини переробляли на грелін RIA.

Грелін РІА

Клітинні супернатанти з клітин греліноми або зразків плазми підкислювали (10% HCl), екстрагували на колонці Sep-Pak C18 і сушили у вакуумі. Аналіз на октаноїл-грелін проводили, як описано раніше 19, з використанням 125 г [Tyr24] маркера греліну людини [1-23] та антитіл до греліну кролика проти людини [1-8], який не розпізнає неацильований грелін. Кролицькі антитіла до греліну людини [14-28], які розпізнають як октаноїл, так і неацильований грелін, використовували для визначення загального вмісту греліну.

Кількісна ПЛР в режимі реального часу

Загальну РНК виділяли за допомогою міні-набору Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Німеччина) і зворотну транскрибували в кДНК за допомогою зворотної транскриптази SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Кількісну ПЛР у реальному часі проводили, як описано вище 55. Послідовності праймерів наведені в таблиці 1. Відносні рівні експресії були виражені щодо GAPDH і скориговані на мінливу мінливість.

Стіл в натуральну величину

імуногістохімія

Тканини шлунка (3 миші/генотип/часовий момент) фіксували 4% параформальдегідом протягом 2 год (4 ° C) з наступною кріозахистом у 30% сахарозі при 4 ° C протягом ночі. Зрізи кріостату (6 мкм) інкубували протягом 2 годин у 0,1 М PBS, що містить 10% ослиної сироватки та 0,3% Triton X-100, а потім інкубували з кролячим антиоктаноїловим греліном (Ab5044, розроблений власноруч) при 4 ° C протягом ночі. Для перевірки неспецифічного зв'язування не було включено жодного первинного контролю антитіл. Після промивання зрізи інкубували з ослиним анти-кролячим Alexa488 (Santa Cruz Biotechnology) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Зрізи монтували в Citifluor і візуалізували під флуоресцентним мікроскопом (Olympus BX41). Кожного шлунка аналізували два зрізи за допомогою програмного забезпечення Cell ^ F Imaging (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Мюнстер, Німеччина). Кількість грелін-позитивних клітин підраховували у 4 випадково обраних полях (20 ×). Інтенсивність фарбування розраховували і виражали як значення сірого від 0 (найтемніший піксель) до 0,65535 (найяскравіший піксель).

Статистичний аналіз

Дані представлені як середні значення ± SEM. Аналіз добового ритму проводили за допомогою безкоштовного програмного забезпечення Cosinor (версія 2.3), яке обчислює циркадний період набору даних, використовуючи процедуру косинору, як описано Нельсоном та співавт. у 1979 р. 56. Всі інші дані були проаналізовані за допомогою Statistica 11 (StatSoft Inc., Талса, ОК, США). T-тест Стьюдента проводили для виявлення відмінностей між двома незалежними групами, коли для порівняння більшої кількості груп використовували одно- або двосторонній ANOVA. Значимість була прийнята на рівні 5%.

Детальніше

Як цитувати цю статтю: Laermans, J. et al. Роль годинникового гена Bmal1 та шлункової клітини, що секретує грелін, у циркадній регуляції системи грелін-КОЗ. Наук. Респ. 5, 16748; doi: 10.1038/srep16748 (2015).

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов надання послуг та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте щось образливим або не відповідаєте нашим умовам чи інструкціям, позначте це як невідповідне.