МЕТОДИ АНАЛІЗУ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ АЗОТУ І АЗОТНОГО СИСТЕМИ У ПРОДУКТІВ
Нальда Ромеро
МЕТОДИ ВСЬОГО ВИЗНАЧЕННЯ АЗОТУ
1. Метод Кельдаля
Характеризується використанням киплячої концентрованої сірчаної кислоти, яка впливає на окисне руйнування органічної речовини зразка та відновлення органічного азоту до аміаку. Амоній утримується у вигляді бісульфату амонію і може бути визначений на місці або лужною дистиляцією та титруванням.
Хімічні та практичні труднощі
Кількісне перетворення азоту в аміак.
Корозійна дія сірчаної кислоти на систему відведення диму.
Екологічні міркування щодо викиду диму та забруднення води металевими каталізаторами.
Збільшити співвідношення сульфату калію/сірчаної кислоти (1 г. 1 м1) t ° 370-410 ° C.
Використання металевих каталізаторів.
Використання H2O2.
Використовувані металеві каталізатори
до) Оксид ртуті
Натисніть на відновлення азоту
Недоліки
Токсичний.
Висока ціна.
Забруднення води.
Утворення стійкої сполуки з аміаком, яка повинна розкладатися з додаванням тіосульфату натрію.
б) Суміш селену або міді та сульфату селену
Селен може спричинити втрату азоту.
в) Суміш мідного купоросу та діоксиду титану
Корисно при аналізі злаків.
Широкомасштабне використання як рутина.
Менш ефективний при відновленні азоту.
Визначення амонію
Аміак у варильному апараті можна визначити різними методами:
- Додавання надлишку лугу до кишечника, дистиляція та титрування амонію.
- Лужна суміш фенолу з гіпохлоритом натрію, що дає синій забарвлення аміаком.
- Лужна суміш саліцилату натрію, нітропрусиду натрію та гіпохлориту натрію, що дає яскравий смарагдово-зелений колір з аміаком.
- Електрометричне визначення за допомогою специфічного іонного електрода та 1% розчину гідроксиду натрію .
Переваги методу Кельдаля
Підходить для різних видів продукції.
Висока надійність.
Використовується як еталонний метод.
Недоліки методу Кельдаля
Небелкові азотисті сполуки заважають.
Використання токсичних або дорогих каталізаторів.
Вибір коефіцієнта перерахунку.
два. Метод Дюма
Характеризується повним піролізом зразка та вимірюванням вмісту азоту в димових газах.
Азот можна виміряти манометром після поглинання вуглекислого газу в лужному розчині або за допомогою теплопровідності в автоматизованих методах.
Це показує задовільну еквівалентність у порівнянні з методом Кельдаля при аналізі кормів та дитячого харчування, хоча і з трохи вищими значеннями.
Недоліки
Включає неорганічний азот.
Потрібні невеликі кількості зразків 5-50 мг, дрібно розділених та однорідних, щоб мінімізувати помилку відбору проб.
Цей метод не можна застосовувати до вологого матеріалу, тому його потрібно попередньо висушити.
3. Радіохімічні методи
Описано два методи:
до) Активація нейтронів
Велика кількість зразка опромінюється нейтронами, що призводить до проходження від 14 Н до 13 Н. Цей період має період напіввиведення 10 хвилин і випромінює гамма-випромінювання, яке реєструється в сцинтиляційному лічильнику. Підрахунок пов’язаний із вмістом азоту у зразку.
Простий; Швидко.
Немає проблем із забрудненням.
Знайдені значення наявні
хороша кореляція з методом
Кельдаль.
Вартість інфраструктури дуже висока.
б) Активація протонів
Подібно до попереднього з варіантом, що зразок опромінюють протонами і здійснюють перетворення 14 N на 14 O, ізотоп, що розпадається з випромінюванням протона та гамма-випромінювання, які реєструються і відносяться до вмісту зразка азоту.
МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ ПРОТЕІНІВ
Існує кілька альтернативних методів визначення білків:
1. Використання коефіцієнта перерахунку
а) Визначте загальний вміст азоту та помножте на коефіцієнт перетворення азоту в білок. Цей коефіцієнт розраховували з урахуванням відсотка азоту, який білок містить у їжі.
Недоліки використання фактора перетворення:
Для цілей розрахунку враховується вміст азоту в основному білку, а не в усій суміші.
Аналізована фракція не обов'язково є чистим білком.
Небілкові корекції азоту не проводяться.
Запропоновано визначати коефіцієнт перетворення азоту в білок за допомогою амінокислотного складу їжі, що аналізується, що ускладнюється при поєднанні продуктів, для яких переважно продовжувати використовувати традиційні фактори, повідомляючи по черзі коефіцієнт, що використовується.
б) Визначте вміст азоту в білках і помножте на коефіцієнт перетворення азоту в білок.
Для відокремлення білка від небілкових азотистих сполук використовувались різні методи, серед яких зазначено:
діаліз та ультрафільтрація мембраною;
коагуляція тепла (неефективна для казеїну та желатину);
Недоліки
Відмінності у білкових фракціях, отриманих різними методами. Слід розглянути можливі затримки білка, осадженого з невеликих небілкових молекул адсорбцією або іонним обміном. Проблеми, пов’язані з використанням фактора перетворення азоту в білок.
2. Хімічні методи
Білки мають широкий спектр хімічної поведінки завдяки властивості амінокислот мати різні типи функціональних груп, хімічним реакціям цих груп та пептидним зв’язкам.
Міркування щодо застосування хімічних методів:
очікується хороша кореляція між цими двома типами визначення білка, коли співвідношення небілків N/білок N є низьким і постійним; Y
є задовільними для молока та злаків та незадовільними для більшості овочів та харчових сумішей.
а) Біуретовий метод
Хімічний принцип
Реакція характеризується фіолетовим відтінком, коли іони міді ускладнюються пептидними зв’язками при лужному pH. Відтінок кольору залежить від виду білка, а його інтенсивність залежить від вмісту білка.
Використаний реагент
Лужний розчин, що містить іони міді в комплексі з тартратом натрію та калію.
550 нм, при 263 нм чутливість збільшується в 10 разів.
Мало застосування було знайдено в аналізі харчових продуктів через наявність таких інтерференцій, як відновлюючий цукор, який зменшує іон міді в лужному середовищі, що дає незадовільні результати. Приклад: молоко.
б) метод "зв’язування барвника"
Хімічний принцип
Характеризується утворенням білкового згустку, забарвленого та нерозчинного продукту реакції білка з кольоровим розчином сульфонової кислоти при рН 2. Пофарбований аніон за допомогою електростатичних асоціацій пов'язується з основними ділянками білка, наприклад з М-аміногрупи лізину, аргініну гуанідину, гістидину імідазолу та кінцевих амінів. Крім того, міжмолекулярні привабливості створюються гідрофобними взаємодіями між білком і неіонною половиною аніона, а також між аніоном, зв'язаним з білком, і неіоногенною половиною аніона в розчині.
Згусток відфільтровують, а надлишок барвника в надосадовій рідині вимірюють колориметрично. Цей показник пов’язаний із вмістом білка.
Міркування
Метод емпіричний, тому слід знайти ідеальну концентрацію барвника, яка насичує білок і утворює згусток, але не втрачає чутливості.
Корисно для рутинного аналізу подібних зразків.
Дешево і швидко.
Точний, як метод Кельдаля.
Використовується як еталонний метод.
Недоліки
Труднощі з пошуком чистих настоянок.
Неоднорідність якості барвників від однієї виробничої партії до іншої, що вимагає калібрування методу з кожною партією.
Він не застосовується до харчових продуктів, які змінюють вміст в аміногрупах (протеоліз, побуріння).
в) Метод лужної дистиляції
Гідроліз амідів у сильному лужному середовищі дає аміак, який переганяється, і його значення пов’язане із вмістом білка.
Встановлено, що вихід аміаку є високовідтворюваним для даного білка.
г) Метод Лоурі
Коли реагент Фоліна додають до білка, він окислюється амінокислотами тирозином, триптофаном, цистином, цистерною та гістидином до синього комплексу молібдену.
Висока чутливість і проста в експлуатації.
Недоліки
Кольорова реакція варіюється залежно від типу білка.
Інтенсивність забарвлення не суворо пропорційна концентрації білка.
Іони калію, магнію, ЕДТА та вуглеводів заважають реакції.
д) Метод титрування формаліну
Надлишок формальдегіду додається до нейтралізованого лугом зразка, який реагує з кожною основною групою лізину та аргініну. Надлишок формальдегіду нейтралізується надлишком стандартного лугу, який титрується і пов'язаний із вмістом білка.
Його відтворюваність нижча, ніж у інших альтернативних методів.
3. Фізичні методи
Міркування
Вони простіші, швидші та вартість аналізу нижча, хоча вартість обладнання висока. Точність цих методів пов'язана з характеристиками матеріалу, що підлягає аналізу. Згода з загальним азотом залежить від матеріалу, який не відрізняється від зразка до зразка.
до) Інфрачервона спектроскопія
Це використовує перевагу поглинання амідної групи пептидного зв'язку при 6,46 Тм.
Швидкий, багатокомпонентний аналіз Неруйнівний.
Недоліки
Перешкоджає вода.
Складний процес калібрування.
б) Відбивна інфрачервона спектроскопія
Зразок висвітлюється шістьма довжинами хвиль, близькими до інфрачервоного випромінювання (0,75-2,5 Тм), і виявляється відбите світло.
Розгляд
Потрібне калібрування набору статистично значущих зразків, проаналізованих традиційними еталонними методами.
Швидкий багатокомпонентний аналіз. Застосовується для твердих матеріалів. Кількісно визначає білок у присутності води.
Недоліки
Крохмаль і ліпіди заважають.
Зсув спектра відбиття через вологу, що міститься в частинках.
Складний процес калібрування.
в) Ультрафіолетова спектрофотометрія
Вимірює білки в розчині з максимальним поглинанням при 280 нм, що відноситься до ароматичних кілець тирозину та триптофану та між 180-220 нм.
Швидкий, неруйнівний.
Корисно для контролю елюентів на хроматографічних колонках.
Втручання інших сполук (нуклеїнові кислоти, нуклеотиди).
г) Рефрактометричні методи
Вимірює пряму рефракцію білка в розчині або зміну показника рефракції, спричинену видаленням білка з розчину.
і) Турбідиметричний метод
Вимірює зменшення інтенсивності світла при проходженні через суспензію білкових частинок. Ця зміна пов’язана із вмістом білка.
F) Електронна спектроскопія
Опромінення матеріалу рентгенівськими променями та кількісне визначення виділених фотоелектронів, характерних для атома N амідної групи білка.
Хороша кореляція із загальним вмістом N.
Інші цікаві групи (сульфідні групи амінокислот) можуть бути визначені одночасно.
ж) Полярографія
Визначає сліди білка.
МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ АМІНОКИСЛОТ
Амінокислоти становлять первинну структуру білка та надають харчову цінність їжі.
Для аналізу амінокислот необхідно розривати пептидні зв’язки білків шляхом гідролізу, який може бути кислим, лужним або ферментативним. Кислотний гідроліз проводять із соляною кислотою концентрації 6N. Реагент повинен бути чистим і не повинен залишати залишків, тому рекомендується гідроліз у газовій фазі. Щоб гідроліз білків був повним, необхідно враховувати такі фактори, як співвідношення кислота/білок, температура та час гідролізу, і уникати присутності кисню в середовищі, застосовуючи вакуум та азот, щоб мінімізувати окислення амінокислот.
Міркування щодо гідролізу кислоти
Кислотний гідроліз впливає на структуру деяких амінокислот, таких як:
- Часткове руйнування треоніну, серину, цистину, цистерни, метіоніну та тирозину.
Знищення цистину, цистеїну та метіоніну запобігає попереднім окисленням зразка перфектичною кислотою, а замість цього визначають цистеїнову кислоту та метіонінсульфон.
Триптофан повністю руйнується соляною кислотою, тому для його визначення необхідно провести лужний гідроліз. - Перетворення: тирозину у похідну хлору; аспарагін до аспарагінової кислоти; і глутамін до глутамінової кислоти.
- Повільне вивільнення ізолейцину та валіну.
Для компенсації втрат, спричинених амінокислотами, а також для кількісної оцінки присутніх амінокислот, до зразка перед гідролізом може бути додана відома кількість внутрішнього стандарту, яка може бути 2-аміномасляною кислотою.
Вільні амінокислоти дериватизуються методами доколонного або післяколонного відділення та розділяють за допомогою іонообмінної хроматографії, високоефективної рідинної хроматографії або газорідинної хроматографії.
Вимоги до дериватизації передколонки: