Предмети

Резюме

Вступ

Тут ми ідентифікуємо велику групу мутацій, пов’язаних з новим ASD, у домені активації Rac1 Тріо, GEF1. Ступінь мутаційної кластеризації, яку ми виявили в домені GEF1 Тріо, та обчислюваний прогнозований вплив цих мутацій de novo, пов'язаних з ASD, на взаємодії Trio-Rac1 свідчать про сильну асоціацію дерегуляції шляху Trio-Rac1 при патологіях, пов'язаних з ASD. . Систематичне дослідження цих мутацій у Тріо-9 виявляє як гіпоморфні, так і гіперморфні мутації, які різко та двоспрямовано впливають на функцію Тріо та вплив Тріо на глутаматергічну нейромедіацію пірамідних нейронів гіпокампа CA1. На моделях ТЕА на тваринах спостерігається патологічне збільшення та зменшення глутаматергічної нейромедіації 17, 18, 19. Наше дослідження розкриває мутації міссенсу, пов'язані з ASD, в одному синаптичному активуючому Rac1 білку, який може спричинити двонаправлені зміни в глутаматергічній нейромедіації і, таким чином, передбачає знижену та надмірну активність Тріо та наслідки синаптичної дисфункції при G-пов'язаній хворобі.

Результати

Мутації, пов'язані з ASD у Тріо

novo

Мутації De novo, пов'язані з ASD у Тріо. місенс-мутації, b нісенітниця та номер копії c в Тріо у осіб з розладами, пов'язаними з РАС. Позначаються різні домени білка, починаючи з терміна N: домен Sec14, повтори спектру, домен GEF1 (складається з домену гомології Dbl (DH1) та домену гомології Плекстрина (PH1)), домену homc 3 Src (SH3), і домен GEF2 (що складається з домену гомології Dbl (DH2) та домену гомології Плекстрина (PH2)). Для кожної мутації надається індивідуальний діагноз разом з інформацією про зміну амінокислотної послідовності Тріо. Положення амінокислотних мутацій NP_009049.2

Повнорозмірне зображення

Згідно з недавнім аналізом Агрегаційного консорціуму Exome (ExAC), заснованим на 60 706 повністю секвенсованих геномах людини, TRIO є одним із 60 найбільш обмежених генів людини, що свідчить про велике функціональне значення. Тріо має винятково низький рівень безглуздих мутацій (z = 6,29) та втрати функції (LoF) безглуздих мутацій (pLi = 1), тоді як у нього середній рівень синонімічних мутацій (z = 0,19) 27. Ще більш дивним є обмеження в домені GEF1/DH1. Примітно, що ми не спостерігали помилок мутації або втрати функції (LoF) у домені GEF1/DH1 у 9 937 24 контрольних геномах (таблиця 1 та рис. 2а), що вказує на сильне збагачення мутацій, пов’язаних з ASD у цій області ( 2б). Ми також не виявили помилкових мутацій у домені GEF1/DH1 у базі даних 1000 Геномів 28 (Додаткова Рис. 1а). Важливо, що синонімічні мутації, перелічені в базі даних 1000 геномів, були присутні в цій області (Додаткова Рис. 1b). У сукупності ці дані вказують на сильне збагачення мутацій, пов’язаних з новим ASD, в області GEF1/DH1 Тріо.

Повний розмір таблиці

Тріо-мутації, виявлені в контрольних та пов'язаних з ASD геномах. до Мутації тріо-9, виявлені в контрольних геномах (від De Rubeis et al., 2014, 24). b Графік показує кількість мутацій, пов'язаних з ASD (червоні смуги) та контрольних (чорні смуги), виявлених у кожному домені Trio-9 у осіб із порушеннями, пов'язаними з ASD, та контрольних осіб без порушень, пов'язаних з ASD, відповідно. Збагачення мутації Trio, пов’язаної з ASD, у кожному домені Trio обчислювали шляхом віднімання кількості контрольних мутацій з числа мутацій, пов’язаних з ASD, які спостерігаються у кожному домені. Прозорі трикутники ілюструють наявність (червоний), відсутність (чорний) та величину збагачення мутацій, пов’язаних з ASD, у кожному домені.

Повнорозмірне зображення

Для оцінки важливості білків Trio та мутацій домену Trio-GEF1/DH1 при розладах, пов'язаних з ASD, ми порівняли очікувану кількість мутацій de novo з такою, що спостерігалася. Ми використовуємо мутаційну модель, розроблену Samocha et al. 29. Результати Samocha et al. були засновані на 1078 випадках РАС та 151 випадку інтелектуальної недостатності, і це дослідження змогло визначити SCN2A та SYNGAP як важливі при розладах, пов'язаних з АСД. У цьому дослідженні ми виявили набагато більшу кількість випадків (4890 для розладів, пов'язаних з РАС), і велику кількість місенс-мутацій, виявлених у TRIO (11 випадків АСД, порівняно з 1,07 випадками, очікуваними для тієї ж кількості осіб у загальній популяції ) різко покращила статистику, що призвело до надзвичайно значущої асоціації цілого геному TRIO з ASD-подібними синдромами (значення P -8; Додаткова таблиця 3). Ми виявили ще сильнішу зв'язок із синдромами, пов'язаними з ASD, для субдомену GEF1/DH1 TR1, що взаємодіє з Rac1 (7 випадків порівняно з очікуваним 0,06, значення P -13; Додаткова таблиця 3).

Мутації ASD в Trio, як передбачається, змінять активацію Rac1

Прогнозовані ефекти мутацій DH1, пов'язаних з ASD, на активацію Rac1. Домен GEF1 у контексті всього білка показаний вище, домен GEF1 позначений пунктирним червоним квадратом. Нижче наведено огляд структури комплексу Trio-GEF1 та Rac1 з двома інтерактивними білками, показаними як сині та помаранчеві мультфільми відповідно (Код Банку даних білків 2NZ8). Мутовані залишки амінокислот при захворюванні, пов’язаному з ASD, показані у вигляді сфер з пурпуровими кольоровими атомами вуглецю. Збільшені вставки представляють взаємодію між залишками амінокислот у білках дикого типу та мутантах. Залишки дикого типу маркуються та відображаються у вигляді штрихового зображення з пурпуровими кольоровими атомами вуглецю. Мутовані амінокислоти показані із зеленими або жовтими атомами вуглецю. Водневі зв'язки/сольові містки показані штриховими лініями. Молекули води, що беруть участь у взаємодіях GEF1-Rac1, позначаються прозорими червоними сферами

Повнорозмірне зображення

Повний розмір таблиці

Експресія Trio-9 I1329HLAL * пригнічує синаптичну функцію

Повнорозмірне зображення

40% в амплітуді AMPAR-eEPSC (рис. 4h, j). Експресія Trio-9 I1329HLAL * не впливала на амплітуду NMDAR-eEPSC (рис. 4i, k). Цей фенотип був надзвичайно схожий на той, що спостерігався у тРНК тРНК. Парне полегшення пульсу (PPF) також не було змінено постсинаптичною експресією Trio-9 I1329HLAL *, що вказує на те, що експресія цього мутанта не впливала на вивільнення пресинаптичного глутамату (рис. 4l).

Експресія Trio-9 K1431M пригнічує синаптичну функцію

Потім ми розглянули мутацію місіонів Trio, Trio-9 K1431M. Особа, що переховує цю мутацію, виявила важкі аутичні симптоми та інтелектуальні вади. Слід зазначити, що попереднє дослідження з використанням мутацій сканування аланіну для виявлення важливих залишків в області GEF1 Тріо визначило цей залишок разом з R1428 критичним для активації Rac1 36. Наше моделювання мутації K1431M передбачило порушення в декількох взаємодіях, опосередкованих водою та воднем, що призвело до зниження спорідненості між GEF1/DH1 доменом Trio та Rac1 (рис. 3 та таблиця 2). Аналіз FLIM показав, що Trio-9 K1431M, як і Trio-9 I1329HLAL *, сильно знижує здатність Trio-9 активувати біосенсор Rac1 у клітинах HEK293 (рис. 5b). Тому, як і передбачалося, активація Rac1 була сильно знижена внаслідок цієї мутації. Потім ми експресували Trio-9 K1431M у пірамідальних нейронах CA1 і виявили, що Trio-9 K1431M фенокопіював Trio-9 I1329HLAL *. Тріо-9 K1431M виробляє зниження на

50% амплітуди AMPAR-eEPSC (рис. 5c), що, ймовірно, також спричинено збільшенням тихих синапсів, оскільки відбулося зменшення квантового вмісту без зміни амплітуди NMDAR-eEPSC або зміни PPF (рис. 5d-f) . Як і у випадку з Тріо-9 дикого типу, варіація амплітуд NMDAR-eEPSC у нейронах, що експресують Тріо-9 К1431М, зумовлена ​​зміною квантового вмісту (Додаткова Рис. 4в). Разом ці дані показують, що Trio-9 K1431M, як і Trio-9 I1329HLAL *, швидше за все, конкурує з ендогенним Trio дикого типу в синапсах і призводить до зменшення синаптичної функції AMPAR. Крім того, ми виявили, що безглузда мутація в домені GEF1 Тріо, яка була виявлена ​​у людини без ASD (Trio-9 S1575N) 28, не впливала на здатність Тріо-9 збільшувати амплітуду AMPAR-eEPSC у нейронах. пірамідальний СА1 (додаткові рис. 1а та 5).

Повнорозмірне зображення

Експресія Trio-9 P1461T пригнічує синаптичну функцію

Повнорозмірне зображення

Trio-9 D1368V призводить до гіперфункції Trio

Конкретна асоціація мутацій Тріо з РАС підтверджується аналізом його близького паралогу - Каліріну, який має унікальний профіль вираження розвитку. Жодних мутацій міссенсу, пов'язаних з ASD, не спостерігалось у Каліріну, незважаючи на те, що він грав подібну роль у регуляції глутаматергічного синапсу. Тріо сильно виражається у ранньому постнатальному розвитку та знижується у віці до 10 років. На відміну від цього, вираз Каліріна досягає свого піку до підліткового віку 11, 12. Слід зазначити, що функція Калірину була пов'язана з нейропсихіатричними розладами пізнього періоду, такими як шизофренія та хвороба Альцгеймера 38, 39, 40, 41. Безглузда мутація в домені GEF1/DH1 калірину, яка інгібувала активацію Rac1, також була виявлена ​​у людини з шизофренією 39. Отже, профілі експресії Тріо та Каліріну, схоже, збігаються з віком початку захворювань, якими вони беруть участь, і припускають, що порушення синаптичної регуляції, опосередковане Rac1 в різні періоди розвитку мозку, призводить до різних захворювань, пов'язаних з мозком. .

Нещодавно було виявлено, що порушення синаптичної регуляції актину, опосередкованої Rac1, лежать в основі розвитку поведінкових фенотипів, пов'язаних з ASD, у добре встановлених моделях тварин, пов'язаних з ASD, захворюваннями 5, 6, 7. Недавнє дослідження також визначило Rac1 як вірогідну точку зближення низки генів ризику ASD 8. Тут ми ідентифікуємо домен активації Rac1 регуляторного білка синаптичного актину, Trio, як гарячу точку для мутацій de novo, пов’язаних з ASD. Оскільки, як вважають, порушення регуляції глутаматергічної нейромедіації лежить в основі поведінкових фенотипів у багатьох тваринних моделях АСД, а також тому, що не виявлено, що білки нижче активності Тріо містять значні мутації, пов’язані з АСД, спокусливо припустити, що змінена функція Тріо є головним моментом збіжності ряду факторів, що породжують РАС. Надалі буде необхідно визначити поширеність зміненої функції Тріо у осіб з РАС та встановити, чи можна застосовувати терапію, пов’язану з Тріо, для зворотних поведінкових фенотипів, пов’язаних з АСД, у значної кількості осіб із цим захворюванням.

Методи

Мутаційне моделювання

Вплив мутацій на стабільність та зв'язування прогнозували за допомогою кристалічної структури з високою роздільною здатністю комплексу Trio GEF1 з Rac1 (код PDB 2NZ8). Розрахунки проводились із використанням програмного забезпечення для молекулярного моделювання ICM (ТОВ «Молсофт»). Енергетичну оптимізацію мутантної конформації білка проводили за допомогою зміщеного ймовірного алгоритму Монте-Карло. Потім зміна вільної енергії в стабільності білка ∆∆ стабільності G (1) та зв’язуванні з білком b зв’язку G (2) розраховували як різницю у згортанні або зв’язуванні вільних енергій мутантного та білка дикого типу:

Мутації з зв'язком ∆∆G> 2 або стабільністю ∆∆G прогнозували як руйнівні для активації Тріо Rac1.

Експериментальні конструкції

Людське Тріо-9 (або Тріо-9 у посиланні 13) було отримано з кДНК Trio-FL, щедро наданої доктором Бетті А. Ейппер (Університет штату Коннектикут). Мутації Trio, пов’язані з ASD, були зроблені з кДНК Trio-9 з використанням ПЛР із перекриттям-розширенням з подальшим клонуванням In-fusion (Clontech). Всі плазміди підтверджували секвенуванням ДНК. КДНК Trio-9 клонували у вектор pCAGGs, що містить IRES-mCherry. Вектор pFUGW, що експресує лише GFP, ко-експресувався з конструкціями pCAGG-IRES-mCherry для посилення ідентифікації трансфікованих нейронів і використовувався як контрольний вектор для візуалізації хребта. Конструкція біосенсора Rac1 знаходилась у структурі pTriEx-HisMyc, як було описано раніше у посиланні 30 і був щедро наданий д-ром Яапом Д. ван Буулом (Санкін).

Трансфекція клітин HEK293

Клітини HEK293T (ATCC) культивували в DMEM з 10% FBS в інкубаторі 37 ° C, забезпеченому 5% CO 2. Клітини наносили на 35-міліметрові скляні пластини, покриті матригелем. Клітини вирощували до злиття 50% перед трансфекцією експресійними конструкціями Trio-9 разом з біосенсором Rac1 з використанням реагенту для трансфекції FuGENE HD. Використовували співвідношення біосенсорної ДНК Trio-9/Rac1 1: 1. Покриті клітини інкубували в трансфекційній суміші протягом 16 год, а потім замінювали свіжими середовищами. Були проведені експерименти HEK293

20 год після трансфекції.

Флуоресцентне зображення протягом усього життя (FLIM)

$$ E = 1 - \ tau DA> \ tau D $$

Фазор біосенсора FRET за відсутності активатора отримували із незалежного препарату. Фазор, що відповідає загартованому донору, розраховували відповідно до рівняння загартування (3). Позиції всіх можливих фазорів, які гасяться з різною ефективністю, описують криву траєкторію на фазовому графіку. Експериментальне положення фазора даного пікселя вздовж траєкторії визначало величину загартування і, отже, ефективність FRET. Вклади фону та донора без акцептора оцінюються з використанням правила лінійної комбінації 49, 52, при цьому фоновий фазор та донор не згасають визначаються незалежно. Всі фазові перетворення та аналіз даних FLIM-даних проводили за допомогою програмного забезпечення SimFCS (Каліфорнійський університет, Ірвін).

Електрофізіологія

Аналіз щільності хребта

Для аналізу щільності хребта, контролю та експериментальних пірамідних нейронів CA1 в органотипових культурах зрізів гіпокампа, виготовлених із щенят щурів Р6, біолістично трансфікували конструкціями FUGW-GFP та pCAGGS-IRES-mCherry приблизно через 18–20 год після посіву. Зображення отримували на DIV 7 за допомогою мікроскопії з надвисокою роздільною здатністю (Elyra Microscope System, Zeiss). Для використання з наявним інвертованим мікроскопом та об'єктивом, що заглиблює олію, зрізи фіксували в 4% PFA/4% сахарози в PBS і промивали 3 × PBS. Для посилення сигналу GFP зрізи потім блокували і пронизували 3% BSA в PBS, що містить 0,1% Triton-X, і фарбували первинним антитілом проти GFP (2 мкг/мл, Life Technologies A-11122) з подальшим промиванням у PBSTx та фарбуванням з кон'югованим Alexa 488 вторинним (4 мкг/мл, Life Technologies A-11034). Далі зрізи обробляли скороченим протоколом 55 на базі SeeDB, намагаючись зменшити сферичну аберацію. Потім зрізи монтували в SlowFade Gold (Life Technologies) для візуалізації. Z-стоси виготовляли із зрізів 30 мкм вторинних верхівкових дендритів

30 мкм від соми. Зображення були отримані з масляним об'єктивом 100 × (100 ×/1,46) в режимі SIM з використанням поставленої SIM-решітки 42 мкм, обробленої та реконструйованої з використанням програмного забезпечення (Zen, Zeiss). Експериментатор, засліплений умовою зображення, виконував аналіз зображення на окремих ділянках за допомогою ImageJ для підрахунку шипів, що відходять убік від дендриту.

Статистичний аналіз

Для статистики мутацій, пов’язаної з ASD у Тріо, ми використовували простий тест Пуассона, подібний до того, що застосовувався у Samocha et al. 29. Очікувана кількість мутацій de novo у білку Trio у 4890 осіб з розладами, пов’язаними з ASD, була розрахована на основі імовірності генно-специфічних мутацій, визначеної Samocha et al. Очікувана кількість мутацій de novo в домені Trio-GEF1/DH1 була оцінена шляхом масштабування очікуваної кількості мутацій у Trio з припущенням рівної ймовірності мутації вздовж гена. Використовували поріг значущості P-значення для геному −6. Для парних електрофізіологічних записів амплітуди eEPSC був використаний тест підписаного рангу Вілкоксона для парних даних. Підсумовані тести рангу Вількоксона використовувались для порівняння електрофізіологічних даних у незалежних умовах. Вимірювання парного полегшення пульсу та дані щільності хребта аналізували за допомогою парного та непарного t-критерію Стьюдента відповідно. Всі проведені статистичні тести були двосторонніми та з усіма тестами Р-значенням