Резюме

Цей протокол дозволяє досліднику виділити та охарактеризувати резидентну тканину макрофагів у різних запалених тканинах ущільнень, вилучених із моделей метаболічних розладів, спричинених дієтою.

Анотація

Вступ

Моделі мишей використовувались для вивчення динаміки захворювань людини. Правильна ізоляція резидентних клітин з тканини мишей у хворому стані може забезпечити платформу для розуміння молекулярного та клітинного внеску в патогенез захворювання 1. Одним із життєво важливих розладів є ожиріння. Частота ожиріння продовжує зростати у всьому світі паралельно з інсулінорезистентністю та цукровим діабетом 2 типу, серцево-судинними захворюваннями та жировими захворюваннями печінки 2, 3. Надмірне споживання поживних речовин є більш упередженим через зменшення фізичної активності, що спричиняє змінені сигнали жирової тканини, що може змінити клітинне середовище інших периферичних тканин, таких як печінка та аорта 4. Таке порушення метаболічного гомеостазу призводить до хронічного низькоякісного системного запалення 5 .

Показано, що класична активація резидента до аорти та печінки, а також залучення її до білої жирової тканини макрофагів (WAT) не тільки ініціює порушення регуляції метаболічних сигналів, але й підтримує запалення 6, 7. Фенотипова та функціональна неоднорідність макрофагів тісно пов'язана з патогенезом ожиріння, пов'язаним із супутніми захворюваннями. Динамічна пластичність поляризації макрофагів дозволяє цим клітинам проявляти різноманітні активовані фенотипи, які координують прогресування та розв’язання запалення. У той час як класично активовані макрофаги (М1) беруть участь у розповсюдженні запалення, альтернативно активовані макрофаги (М2) були пов'язані з розв'язанням та відновленням тканин 9, 10 .

Коли організм зазнає метаболічного стресу, біла жирова тканина накопичується ненормально. Збільшена жирова тканина привертає та утримує запальні клітини, які глибоко змінюють нормальну функцію адипоцитів, сприяючи підвищенню резистентності до інсуліну, гіперглікемії та цукрового діабету 2 типу, в кінцевому підсумку резистентності до інсуліну або гіперглікемії 11, 12. Паралельно проводиться реконструкція білої жирової тканини у відповідь на запальні сигнали шляхом інфільтрації класичних активованих макрофагів (АТМ) жирової тканини (М1) 13, 14. Цей багатоклітинний орган подає каскад сигналів, які порушують нормальну функцію інших органів тіла, таких як аорта та печінка 4 .

Печінка - це метаболічна електростанція, яка адаптується у відповідь на подразники від жорстко нерегульованого ВАТ 15. Печінкові макрофаги або клітини Купфера у відповідь на метаболічні зміни виділяють запальні цитокіни, які трансформують як паренхіму, так і непаренхімний клітинний фенотип і сприяють ремоделюванню тканин. Накопичення ліпідів у печінці, запалення, надмірні відкладення позаклітинного матриксу, некроз та можлива втрата функції слідують запальним образам, що сприяє широкому спектру пошкоджень печінки, пов’язаних з неалкогольною жировою хворобою печінки 16 17, з, 18 .

Паралельно порушеному ВАТ та функції печінки великі артерії накопичують ліпіди в артеріальній стінці, оскільки організм зазнає хронічного метаболічного стресу 19. Накопичення артеріальних ліпідів викликає секрецію хемокіну активованими ендотеліальними клітинами та подальшим рекрутуванням моноцитів 20. Після набору моноцити проліферують, диференціюються, поглинають ліпопротеїни і стають пінистими клітинами. Атерогенез ініціюється і підтримується завдяки запальній активності рекрутованих та насичених ліпідами макрофагів, що мешкають у тканині. Піддаючись позаклітинним та внутрішньоклітинним сигналам стресу, що передаються в цьому атерогенному мікросередовищі, ці макрофаги потім беруть участь в каскаді сигналізації апоптозу. Оскільки ці пінопластові клітини гинуть, вони вносять свій внесок у вміст ліпідів, що заповнює некротичну основу ураження, що потім призводить до розриву нальоту, інфаркту міокарда та інсульту.

У сукупності неоднорідність фенотипів макрофагів частково організовує ожиріння, спричинене запальними змінами нормальних тканин, таких як ВАТ, печінка та аорта 8, 21. Характеристика завербованих та резидентних макрофагів може дати уявлення про потенційні молекулярні мішені, які маніпулюють фенотипом макрофагів 1. Для ефективної характеристики макрофагів у запалених тканинах, спричинених ожирінням, одноклітинна суспензія може бути отримана шляхом ферментативного травлення. Такі протоколи дисоціації повинні бути ефективними для достатньої деградації сполучної тканини, мінімізуючи загибель імунних клітин та забезпечуючи оптимальну роботу клітин. Суміш ферментів залежить від типу тканини та її структурного складу. Стійкі тканини, такі як аорта, вимагають вищої активності ферментів, порівняно з печінкою та ВАТ, для досягнення дисоціації тканин. З суспензії клітин резидентні макрофаги можна однозначно охарактеризувати або виділити для подальшого подальшого аналізу, такого як транскрипційне профілювання.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Усі експериментальні протоколи (розділи 1, 1.2 та 1.3) були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (IACUC) Пенсильванського державного університету.

Тканина Приготування дисоціаційних буферів Остаточний обсяг Зберігання інформації
Біла жирова тканина (WAT) Буфер роз'єднання: 2,5% HEPES, 10 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну (BSA), 3 мг/мл (0,3%) колагенази типу II у модифікованому середовищі орел Дульбекко (DMEM) з 4,5 г/л глюкози без L-глутаміну та пірувату натрію 500 мл мінус 80 ° C (аликвоти 10 мл)
Печінка 25 х інфузійний буферний концентрат (PBC): 3,55 М NaCl, KCl, 168 мМ 240 мМ HEPES, 150 мМ NaOH у дистильованій деіонізованій воді H2O 500 мл мінус 20 ° C (аліквоти 40 мл)
Розчин для консервації (PRB): 1% BSA 1 х перфузійний буфер 1 л 4 ° C
Буфер роз'єднання: 1 х перфузійний буфер, доповнений 4,76 мМ CaCl2 і 72 ОД/мл колагенази IV типу 50 мл (на мишу) Готуйте безпосередньо перед використанням
Аорта Буфер роз'єднання: 125 ОД/мл колагенази типу XI, 60 ОД/мл гіалуронідази типу I, 60 ОД/мл ДНКази I, 450 ОД/мл колагенази типу I, 20 мМ HEPES 1 х сольовий розчин фосфатного буфера (PBS) 500 мл мінус 80 ° C (аликвоти 10 мл)

Таблиця 1: Специфічні рецептори буферного перфузійного буфера.

1. дисоціація та ізоляція тканин

2. Потік цитометрії та фарбування FACS

Флуорофор R-фікоеритрин (PE) PE/ціанін (Cy) 7 PE/ціанін (Cy) 5 Тихоокеанський синій (PB)
Лазер (нм) Синій (488 нм)/жовтий (561-570 нм) - зелений (532 нм) Синій (488 нм)/жовтий (561-570 нм) - зелений (532 нм) Синій (488 нм)/жовтий (561-570 нм) - зелений (532 нм) Фіолетовий (405 нм)
Максимальне збудження (нм) 496 496 496 401
Максимальне випромінювання (нм) 578 785 667 455
Фенотиповий маркер F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 ΑX інтегрин, інтегрин αX ланцюг, CR4, p150, ITGAX InteM інтегрин, Mac-1 Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, ACV
Конкретний тип клітини Резидентні макрофаги Класичні активовані макрофаги (M1) Моноцити/макрофаги Лейкоцити (макрофаги/моноцити, лімфоцити та гранулоцити)
Підмножина дендритних клітин Дендритні клітини, NK-клітини, активовані Т-клітини та підмножина кишкових інтраепітеліальних лімфоцитів (IEL) Гранулоцити, дендритні клітини, NK-клітини та підмножини Т і В-клітин
Коефіцієнт розведення 1:50 1: 100 1: 100 1: 100
Ізотип контролю PE щур IgG2a PE/Cy7 вірменський хом'як IgG PE/Cy5 IgG2b щура Тихоокеанський синій щур IgG2c

Таблиця 2: Список специфічних антитіл, мічених флуорофором, для дискримінації резидентних макрофагів.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

При використанні мишей з дефіцитом аполіпопротеїну Е (KO ApoE) C57BL/6 (BL6) мишей, які витримували дієту з високим вмістом жиру (HCHFD або HCD) протягом 18 тижнів, 1 x 10 4 - 2 x 10 4 CD45 + + аорти F4/80 макрофаги можна виділити, коли два зразки об’єднані. Розсічена печінка мишей, яких годували HFHCD KO ApoE, продукувала більше 5 x 10 5 сортованих клітин Купфера (що залежить від часу, доступного для сортування). Коли я використовую дієту з високим вмістом жиру (HFD), яку годували мишами дикого типу (WT) C57BL/6, жирову тканину (ATM), що проживає в макрофагах, від 5 x 10 5 до 1 x 10 6 можна замовити з фракції стромальних судин (SVF). Вищезазначена кількість макрофагів, які можна замовити з даної тканини, була придатною для аналізу експресії генів кількісної полімеразної ланцюгової реакції (qPCR) у реальному часі. Для тканин, де відновлюється менша частина популяції макрофагів, таких як аорта, рекомендується використовувати осаджувачі Co (наприклад, глікоген) і осадження протягом ночі, коли для цих аналізів необхідна ізоляція РНК.

виділення

Малюнок 2: Профіль транскрипції генів відсортованих популяцій клітин Купфера з розсіченої перетравленої печінки мишей KO ApoE, що зберігаються в HCD протягом 18 тижнів. (ДО) Загальна схема блоків для характеристики та класифікації популяцій клітин Купфера. (B) Аналіз експресії генів експресуючих Ron (Ron +) та неекспресуючих (Ron -) впорядкованих CD45 ++ макрофагів F4/80 за допомогою кількісної RT ПЛР. Аналіз t-тесту студентів проводили із застосуванням статистичного програмного забезпечення, і значення представлені як середнє значення ± SEM. P 31. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.


Малюнок 3: Характеристика ATM, виділеного з розсіченої білої жирової тканини від мишей WT BL6, яких годували HFD протягом 18 тижнів. Загальна блок-схема (ДО), для характеристики та класифікації жирової тканини, отриманої з популяцій макрофагів (B) Відсоток клітин Ron + у межах CD45 + + CD11c з F4/80 - та CD45 + + CD11c з F4/80 + у популяціях макрофагів, відсортованих за WAT. Малюнок змінено від Yu et al. (2016) 31. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори не мають конфлікту інтересів для розголошення.