предметів
реферат
Каппа-глутатіонтрансфераза (GSTK1-1), яку також називають білком оксидоредуктази, подібним до дульфідного бонда (DsbA-L), бере участь у посттрансляційній мультимеризації адипонектину і негативно корелює з ожирінням у мишей та людей. Ми досліджували адипонектин у мишей Gstk1 -/- і, на диво, не виявили відмінностей між загальним рівнем адипонектину в сироватці крові або мультимерами з високою молекулярною масою (HMW) порівняно з нормальним контролем. Нередукуючий електрофорез у поліакриламідному гелі та вестерн-блоттінг також продемонстрували подібний розподіл мультимерів із низьким, середнім та HMW у нормальних та Gstkl -/- мишей. Варіації адипонектину корелювали з толерантністю до глюкози та рівнями фосфорильованої АМФ-кінази, але ми виявили подібну толерантність до глюкози та подібні рівні фосфо-5-АМФ-активованої протеїнкінази у нормальних та Gstkl -/- мишей. Отже, наші висновки свідчать про те, що GSTK1-1 не є абсолютно необхідним для мультимеризації адипонектину in vivo, і за відсутності GSTK1-1 можуть бути активовані альтернативні шляхи.
Адипонектин - це адипокін, який головним чином секретується білою жировою тканиною, яка виконує різні функції в регулюванні метаболізму глюкози та жирних кислот, викликаючи окислення жирних кислот, пригнічуючи печінковий глюконеогенез та підвищуючи чутливість печінки та м’язів до інсуліну. Низький рівень циркулюючого адипонектину пов'язаний із ожирінням та резистентністю до інсуліну, 2, 3 та високий рівень корелює із захистом від патологій, пов'язаних із ожирінням, включаючи діабет 2 типу та метаболічний синдром, гіпертонію 4, атеросклероз 6 та неалкогольну жирову хворобу печінки. 7 Адипонектин циркулює в крові у вигляді трьох основних дисульфід-пов'язаних олігомерних форм; низькомолекулярний тример, середньомолекулярний гексамер та високомолекулярний 12-18 мультимерів. Існують вагомі докази того, що різні олігомери мають різні біологічні функції. 1, 8
Недавнє дослідження на клітинах 3T3-L1, 9 повідомило, що олігомеризації адипонектину сприяла глупатіонтрансфераза (GSTK1-1) каппа і що нокдаун GSTK1-1 суттєво знизив рівень секретованого HMW адипонектину в адипоцитах 3T3-L1. GSTK1-1 експресується в різних тканинах, включаючи білу жирову тканину, основне джерело адипонектину in vivo. 9, 10, 11 експресія GSTK1-1 також негативно корелювала із ожирінням у мишей та людей, і тому була запропонована як нова мета для розробки препаратів для лікування інсулінорезистентності та пов'язаних з цим метаболічних розладів. 9
Незважаючи на те, що GSTK1-1 має активність глутатіонтрансферази як цитозольні GST, він локалізований у мітохондріях та пероксисомах 12, і його структура суттєво відрізняється від структури цитозольних та мікросомальних GST. GST Kappa демонструють подібну складку, як бактеріальні дисульфідні утворюючі білки, такі як дисульфід-пов'язана оксидоредуктаза A (DsbA). 11, 13, 14 Структурна подібність GSTK1-1 до DsbA призвела до думки, що його слід перейменовувати в DsbA-подібний (DsbA-L); Однак він схожий на бактеріальні ізомерази 2-гідроксихромен-2-карбоксилату. Хоча ми показали, що GSTK1-1 має значну активність глутатіон трансферази in vitro, 13 ми розробили мишей-нокаутів GstK1 для дослідження його біологічної ролі in vivo. Ми відзначали, що дефіцит GSTK1-1 спричиняє гломерулярну нефропатію, включаючи зміни базальної мембрани, процес подоцитів та мікроальбумінурію. Цікаво, що цей фенотип подібний до фенотипу у мишей з дефіцитом адипонектину, які демонструють альбумінурію та злиття процесів подоцитів. 16
Враховуючи очевидну роль GSTK1-1 в олігомеризації адипонектину та подібність у GSTK1-1 та дефіцитних адипонектином фенотипах мишей, ми зараз досліджували вплив дефіциту GSTK1-1 на мультимеризацію адипонектину та функції, опосередковані адипонектином, у мишей GstK1 -/-.
Матеріали і методи
Описано покоління мишей GstK1 -/-, що використовувались у цьому дослідженні. У цьому дослідженні використовували п’ятнадцять самців мишей GstK1 -/- та їх контроль дикого типу у віці від 12 до 20 тижнів. Дієта з високим вмістом жиру (Speciality Feeds, Glen Forrest, WA, Австралія) вводилася за бажанням протягом 8 тижнів і складалася з 23% жиру, 0,19% холестерину та 43% загальної засвоюваної енергії, отриманої з ліпідів.
Тести на толерантність до глюкози
Мишей голодували протягом 6 годин перед визначенням рівня глюкози в крові за допомогою глюкометра Optium Xceed (Abbot Diagnostics, VIC, Австралія). Потім мишам внутрішньочеревно вводили 2 г/кг D-глюкози (Sigma Aldrich, Castle Hill, NSW, Австралія) і вимірювали рівень глюкози в крові кожні 15 хвилин протягом 1 години.
Імуноаналізи на HMW-специфічні та HMW-специфічні адипонектинові препарати (ІФА)
Загальний (системи R і D, Міннеаполіс, Міннесота, США) та специфічний для HMW (Alpco Diagnostics, Salem, NH, USA) рівень адипонектину в сироватці крові вимірювали за допомогою комерційних наборів ELISA згідно з інструкціями постачальника.
Вестерн-блот
Для адипонектину в сироватці крові розведення 2,5 мкл мишачої сироватки 1: 1500 було розділено на одну смужку на невідновлювальному, денатуруючому 4-20% SDS-поліакриламідному гелі (Biorad, Геркулес, Каліфорнія, США). Для повністю активованої фосфо-5-AMP протеїнкінази (AMPK) печінку гомогенізували в буфері T-PER (Thermo Scientific, Рокфорд, Іллінойс, США) з доповненням протеазою (Roche, Castle Hill, NSW, Австралія) та інгібіторами фосфатази ( Merck, Дармштадт)., Німеччина). Кількість білків визначали за допомогою набору для аналізу білка BCA (Thermo Scientific) та 20 мкг білка, розділеного на смугу. Гелі блотували на мембранах Immobilon PVDF (Millipore, Billerica, MA, США) і блокували на ніч при 4 ° C у 2% BSA у буферному сольовому розчині (100 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,5) були досліджені анти-адипонектиновими антитілами (Millipore), анти-тоталом або анти-фосфо Thr172-AMPK (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Мембрани досліджували кон’югованими з HRP вторинними антитілами (Dako, Produktionsvej, Данія), розробленими з використанням посилених хемілюмінесцентних реагентів (GE Healthcare Bio-Sciences, Rydalmere, NSW, Австралія) і піддавали дії рентгенівської плівки.
результат
Спочатку ми використовували вестерн-блот, щоб підтвердити, що GSTK1-1 експресується в білій жировій тканині нормальних мишей і не присутній у мишей Gstkl -/- (Малюнок 1а).
( a ) Анти-GSTK1 вестерн-блот на білій жировій тканині гонад у мишей GSTK1 +/+ та GSTK1-/-. ( b ) Загальний адипонектин у сироватці крові, виміряний методом ІФА у мишей GSTK1 +/+ та GSTK1 -/-, які годувались нормальним харчуванням. N = 15 для обох груп. ( c ) Сироватка адипонектину HMW, виміряна методом ІФА у мишей GSTK1 +/+ та GSTK1 -/-, яких годували нормальною чау-їжею або дієтою з високим вмістом жиру. N = 5 для всіх груп. ( d ) Виявлення мультимеру адипонектинового сироватки за допомогою SDS-поліакриламідного гелю нередукуючим електрофорезом з подальшим вестерн-блоттингом у мишей GSTK1 +/+ та GSTK1-/-. ( e, f ) Внутрішньочеревинний тест на толерантність до глюкози у мишей GSTK1 +/+ та GSTK1 -/-, яких годували або звичайною чау ( e ) або дієта з високим вмістом жиру ( f ). N = 6 для всіх груп. ( g ) Рівні фосфо- та загального рівня АМФК у печінці, виявлені вестерн-блот. Для всіх ляпок показана репрезентативна пара однієї з чотирьох пар віку та статі GSTK1 +/+/GSTK1-/- миші.
Повнорозмірне зображення
Для вивчення розподілу адипонектину за розміром у сироватці ми використовували невідновлюючий електрофорез у поліакриламідному гелі SDS для фракціонування сироватки від мишей з високим вмістом жиру, яких годували протягом 8 тижнів, та характеризували мультимери адипонектину за допомогою вестерн-блот. Ми виявили подібний розподіл низькомолекулярних, середньомолекулярних та HMW мультимерів як у мишей дикого типу, так і у мишей GstK1 -/- (рис. 1г).
Оскільки рівень адипонектину корелював із покращеною толерантністю до глюкози, ми піддавали внутрішньочеревному тесту на толерантність до глюкози мишей дикого типу та GstK1 -/- мишей, яких годували або звичайною дієтою (рис. 1е), або дієтою з високим вмістом жиру (рис. 1е). Ніяких відмінностей у концентрації глюкози в крові натще або кліренсі глюкози в крові не спостерігалось у мишей дикого типу та GstK1-/-.
Адипонектин сприятливо впливає на чутливість до інсуліну завдяки фосфорилюванню та активації АМФК. Однак у нашому дослідженні не виявлено відмінностей у рівнях фосфо-AMPK у печінці між мишами дикого типу та мишами GstK1 -/-, які харчуються з високим вмістом жиру (рис. 1g).
обговорення
Адіпонектин дуже цікавий завдяки своїй вирішальній ролі в підтримці чутливості до інсуліну та протизапальній дії. Посттрансляційна мультимеризація адипонектину до низькомолекулярних, середньомолекулярних та видів HMW має особливе значення, оскільки корисні метаболічні ефекти адипонектину значною мірою пояснюються формою HMW. Оскільки GSTK1-1 бере участь у посттрансляційній олігомеризації адипонектину, а його експресія в жировій тканині негативно корелює з метаболічним синдромом у мишей та людей, 9 припустили, що миші з дефіцитом GSTK1-1 можуть страждати від великого дефіциту олігомерів адипонектину і мати фенотип, що відображає відхилення в чутливості до інсуліну. У попередньому дослідженні ми виявили, що миші GstK1 -/- мали дещо нижчий рівень адипонектину в сироватці крові (Р = 0,047), але ця різниця не була присутня в поточному дослідженні з більшою кількістю мишей. Дивно, але в цих дослідженнях не виявлено змін загального вмісту адипонектину в сироватці крові та рівня мультимеризації. Крім того, ми не виявили жодних доказів зниження толерантності до глюкози або рівня фосфо-AMPK, фенотипів, які можна було б передбачити, якщо миші Gstk1 -/- демонстрували значний дефіцит адипонектину HMW.
Кілька білків, включаючи ендоплазматичний ретикулум-асоційований білок 44 (ERp44) та ендоплазматичний оксидоредуктин-1-подібний білок (Ero1-Lα), беруть участь у мультимеризації, переносі та секреції адипонектину (огляд див. Wang et al. 1) . Можливо, що ті чи інші молекулярні білки шаперону можуть також сприяти мультимеризації дисульфід-пов'язаного адипонектину та забезпечувати альтернативні компенсаторні шляхи олігомеризації у відсутності GSTK1-1.
Схожість ниркової патології (альбумінурія та аномалії процесу подоцитів), що спостерігається у мишей GSTK1-1-15 та 16 мишей з дефіцитом адипонектину, цікаво, враховуючи, що дефіцит дефіциту GSTK1-1 обумовлений мультимеризацією адипонектину. Однак, оскільки деякі функції адипонектину, як видається, специфічні для олігомерів, і оскільки розподіл олігомерів за розмірами середньої молекулярної маси та категорій HMW є широким (див. Малюнок 1г), можливо, GSTK1-1 відповідає за формування певної підмножини олігомерів, які не відрізняються методами, які ми використовували в цьому дослідженні.
Ці дані свідчать про те, що будь-яка спроба фармакологічно підвищувати молекулярні шаперони, що сприяють мультимеризації адипонектину, не може призвести до чистого збільшення HMW адипонектину. Отже, відсутність ефекту дефіциту GSTK1-1 на мультимеризацію адипонектину, про яке повідомляється в цьому дослідженні, негативно впливає на припущення, що GSTK1-1 є мішенню для терапевтичного втручання при резистентності до інсуліну та пов'язаних з цим розладах. 9