Предмети
Резюме
Довіритель
Невус шпіца - це набуте меланоцитарне ураження, яке зазвичай розвивається у дітей та підлітків, хоча у дорослих це не рідкість. Класично вважається, що він доброякісний і управляється консервативно. Однак з моменту його опису Софі Шпітц у 1948 р. 1 його діагноз викликає занепокоєння, оскільки не завжди можна поставити однозначний діагноз невуса Шпіца проти меланоми.
Хоча нині систематично оцінюються певні характеристики, щоб розрізнити невуси шпіца та меланоми, різні експерти можуть по-різному визначати відносну важливість кожного з наступних критеріїв: розмір, форма, обмеження стикових гнізд, поширення вгору в епідермісі, розширення до підшкірні, еозинофільні глобули, мітотичні фігури та їх поверхневе або глибоке розташування всередині пухлини, гігантські клітини, наявність виразки та зміни строми. 2, 3, 4, 5 Крім того, більшість уражень не мають багатьох загальноприйнятих критеріїв, які зазвичай використовуються для гістопатологічної діагностики пухлини, що підкреслює відсутність об'єктивних критеріїв для прогнозування біологічної поведінки цих уражень. 3, 6, 7 Класифікація деяких випадків як метастази невусів шпіца 1 ілюструє труднощі точного відмежування деяких невусів шпіца від меланоми на основі виключно гістологічних критеріїв. Тому діагностичний термін „атипова пухлина Шпіца” використовується для опису уражень, що відхиляються від типового вигляду невусів Шпіца та мають невизначене біологічне значення. 7
Оскільки діагностика підгрупи уражень залишається складною, метою цього дослідження було оцінити експресію великої групи маркерів, використовуючи рутинні імуногістохімічні методи, щоб забезпечити загальнодоступний набір білків для розрізнення невуса Шпіца та меланоми. Ми порівняли ознаки експресії білка в обох серіях типових новоутворень Шпіца та меланом вертикальної фази росту, намагаючись створити потужний інструмент, який дозволяє прогнозувати біологічну поведінку меланоцитарних уражень. Результати забезпечують набір з дев'яти диференційовано виражених маркерів у невомах Шпіца проти меланом, корисних для диференціальної діагностики обох меланоцитарних уражень.
Матеріали і методи
Побудова зразків тканин та тканинних матриць
Було вивчено 90 зразків, включених до парафіну та закріплених формаліном з архівів Департаменту патології лікарні Universitario 12 de Octubre, Мадрид, зібраних між 1995 і 2005 рр. Двадцять вісім відповідали типовим невусам шпіца, що відповідає характеристики веретенних та/або епітеліоїдних гнізд меланоцитів, розміри 3 та 62 непітцоїдні меланоми у первинній вертикальній фазі росту. Вертикальну фазу росту визначали за заздалегідь встановленими критеріями: 8 усі гнізда пухлинних клітин в епідермісі менші, ніж принаймні одне в дермі, наявність гнізд шкірних пухлинних клітин шириною 25 і більше клітин та активність мітотичної у внутрішньошкірних новоутворених клітинах . Хворих на меланому лікували за стандартними критеріями: хірургічна резекція з адекватними краями. Ад'ювантна терапія інтерфероном або хіміотерапія при метастатичних захворюваннях застосовувались за клінічних показань.
Репрезентативні зафарбовані гематоксилін-еозином зрізи оцінювали за гістологічними характеристиками авторів, а блоки відбирали на основі адекватної тканини (товщиною не менше 1 мм) 9 для побудови тканинних матриць.
Тканинний мікрочип, що містить невуси шпіца та ще два з VGP-меланомами, був зібраний, як описано вище, 9, включаючи щонайменше два відливи діаметром 1,5 мм з висококлітинних ділянок первинних парафінових блоків. Крім того, нормальні тканини (переважно реактивні лімфатичні вузли, мигдалини та шкіра) розміщувались на масивах як внутрішній контроль.
Імуногістохімічна система та оцінка.
Імуногістохімічне фарбування проводили на зрізах тканин розміром 3 мкм з блоків мікрочипів тканин із використанням 22 різних первинних антитіл проти біологічно важливих білків (джерело та концентрація вказані в таблиці 1). Імунодетекцію проводили за допомогою системи візуалізації LSAB або Envision (обидва - від Dakocytomation, Glostrup, Данія), використовуючи діамінобензидиновий хромоген як субстрат. Всі зрізи були протитоковими фарбованими гематоксиліном (DAKO).
Повний розмір таблиці
Негативні контролі отримували, опускаючи первинне антитіло. Пороговий відбір та внутрішній контроль антитіл були встановлені раніше для полегшення відтворюваності методу згідно з опублікованою літературою 9 (див. Таблицю 1). Усі випадки були оцінені незалежно двома патологоанатомами і були зареєстровані як позитивні з урахуванням експресії білка в новоутворених клітинах та специфічного зрізу для кожного маркера. Будь-які розбіжності у відсотках позитивних клітин були усунені шляхом одночасної переоцінки зрізів.
Статистичний аналіз
Точний тест Фішера використовувався для оцінки того, чи пов'язана конкретна експресія білка з даним ураженням, будь то невус Шпіца або меланома. Статистичне значення було зроблено для значень р 10, щоб уникнути впливу багаторазових тестів. Клінічні та гістопатологічні дані були зібрані після проведення всіх статистичних досліджень (Таблиця 2).
Повний розмір таблиці
Результати
Клінічна та гістопатологічна характеристика.
Серія включає 90 пацієнтів (52% жінок та 48% чоловіків) у віці від 3 до 91 року. Середній вік пацієнтів із невусами Шпіца та меланомою становив 21,6 та 62 роки відповідно. Місце ураження було відомо в 71 з 90 випадків (79%), що є найпоширенішими кінцівками невусів шпіца (46%), а тулуб - меланомами (31%). Усі пацієнти з невусами Шпіца були живі без метастазів, тоді як у 56% (35 із 62) вертикально зростаючих меланом розвинулися метастази, а 34% (21 із 62) померли.
У більшості випадків невусів шпіца виявлялися епітеліоїдні або веретенові меланоцити без значної цитологічної атипії (рис. 1). Ні в одному з 28 випадків невусів шпіца не було виявлено мітотичних фігур або розширення пагетоїдів. Гістологічне дослідження меланом (рис. 2) показало, що найпоширенішим підтипом меланоми, згідно з Класифікацією Всесвітньої організації охорони здоров’я меланоми, була поверхнево розповсюджена меланома (29 із 62 випадків, 47%). Двадцять один із 62 випадків меланоми (34%) був виразковим, а 69% (43 із 62 випадків) мали індекс Бреслоу> 1 мм. Більшість із них мали метастази під час діагностики (35 із 62 випадків, 56%). У таблиці 2 узагальнено клінічні та гістопатологічні дані цієї серії.
Два циліндри типових невусів шпіца (H&E; оригінальне збільшення: × 100 ( до, b ) і × 400 ( c, d )).
Повнорозмірне зображення
Два циліндри первинних меланом VGP (H&E; початкове збільшення: × 100 ( до, b ) і × 400 ( c, d )).
Повнорозмірне зображення
Профіль експресії у шпіцових невусів та меланоми
Результати експресії білка у невусах шпіца та меланомі докладно викладені в таблицях 3 та 4 та проілюстровані на малюнку 3. Імуноофарбовування для специфічних меланоцитарних маркерів показало позитивність S-100 у всіх випадках, експресія мелану -A у більшості невусів шпіца (96 %) та меланоми (92%), тоді як HMB-45 був виражений лише у 44%, 12 з 27 випадків невусів шпіца порівняно з 95% (59 з 62) у випадках меланоми.
Повний розмір таблиці
Повний розмір таблиці
Репрезентативне імуногістохімічне фарбування у VGP-меланомах та невусах Spitz для значущих білків, включаючи p21 ( до - d ), сурвівін ( і - h ) та кавеолін ( i - л ) (початкове збільшення: × 100 та × 400).
Повнорозмірне зображення
Що стосується регуляторів клітинного циклу, циклін D1 демонстрував високий рівень експресії в невусах Шпіца (17 з 23, 74%) і суттєво знижувався в меланомах первинної вертикальної фази росту (10 з 61, 16%). Істотних змін у p16, p53 або Rb не виявлено, тоді як помітно вища ядерна позитивність до p21 спостерігалась у більшості новоутворень Шпіца (91%, 21 з 23) порівняно зі злоякісними пухлинами, у яких p21 виражався лише у 27% ( 17 із 62) випадків (рис.3).
Проліферативну активність оцінювали за допомогою Ki-67 та топоізомерази II α імунозабарвлення. Невуси шпіца показали значно нижчий рівень Ki-67 та топоізомерази α, оскільки позитивних плям клітин було дуже мало (11 показали значну надмірну експресію в невусах шпіца (25 з 26, 96%). Обидва маркери) порівняно з меланомами (23 з 53, 43% та 26 з 54, 48% відповідно).
Обговорення
Нещодавно виявляється, що порівняльна геномна гібридизація та флуоресцентна гібридизація in situ у тканинах ураження представляють корисні доповнюючі методики у складних випадках шпітоїдних меланоцитарних новоутворень, 16, 17, 18, 19, 20, 21, хоча ці молекулярні методи з високою роздільною здатністю ще не отримали Вони широко доступні, і їх іноді важко інтерпретувати. Тому потрібні додаткові дослідження, щоб оцінити ці методи як діагностичні засоби. Гістопатологічне дослідження залишається золотим стандартом для розрізнення невусів шпіца від меланоми, хоча об'єктивних критеріїв для прогнозування біологічної поведінки конкретного ураження немає. Раніше кілька досліджень, в основному заснованих на експресії одиничних або кількох білків, намагалися пролити світло на багаторічні суперечки навколо пошкоджень шпітоїдів 5, 15, 22, 23, але поки не відомо, що маркери надійно розрізняють два новоутворення. Отже, ні HMB-45, AgNOR, циклін D1, c-myc, c-fos, теломераза, cdc-7, антилептиновий рецептор, BCL-2, p53, ні p16 не виявилися корисними для розрізнення невусів шпіца від меланоми . 13, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33
У цьому дослідженні ми провели порівняльний аналіз експресії білка, використовуючи широку панель антитіл між класичними невусами Шпіца та меланомами вертикальної фази росту. За допомогою аналізу тканинних мікрочипів, високопродуктивного середовища, що дозволяє оцінювати різні маркери у великій кількості меланоцитарних пухлин, ми виявили специфічний профіль експресії білка, який відрізняє типовий невус Шпіца та нешипоподібну меланому (Таблиця 2).
На відміну від меланоми, надмірна експресія цикліну D1, яка спостерігається у невусах Шпіца, схоже, не пов’язана з проліферацією клітин. Отже, як зазначалося раніше, Ki-67, ядерний антиген, пов'язаний з клітинним циклом, ядерний сурвівін, мітотичний регулятор, що зберігає стабільність мікротрубочок 38 і топоізомерази II α, що виражається виключно в проліферуючих відділах пухлин і нормальних тканин, 39 значне збільшення меланоми проти невуса. 8, 40, 41, 42, 43 Хоча меланоми демонструють більш високі показники проліферації (37 проти 0% у невусах шпіца) при оцінці за допомогою Ki-67, у кількох випадках невуси шпіца виявляються розсіяні позитивні клітини у верхній частині ураження, тоді як меланома має ядерну маркування протягом усього ураження. 41, 42
Структурний каркасний білок кавеолін, з додатковою роллю в трансдукції сигналу плазматичної мембрани, продемонстрував втрату експресії у меланомах вертикальної фази росту порівняно з невусами. Ці результати узгоджуються з попередніми звітами 9 і підтримують зменшення їх експресії та формування кавеол в онкогенно трансформованих клітинах. 44
Крім того, раніше було показано, що деякі білкові маркери, включені в наше дослідження, беруть участь у опосередкуванні взаємодій клітин-матрикс та беруть участь у вторгненні та прогресуванні меланоми. 11 Це дослідження також виявляє високу експресію серин/треонінкінази PKC α та кислого та багатого цистеїном білка остеонектин/SPARC у невусах Шпіца (96% для обох білків) та статистично значущу різницю порівняно з меланомами (48 та 43% відповідно, с. 11, 45. Ці спостереження в основному свідчать про те, що глибока інвазія дерми не обов'язково пов'язана зі злоякісною пухлиною, і вони визначають два нові маркери, які можна використовувати для розрізнення меланом від невусів шпіца.
Жодного з цих висновків недостатньо для виключення діагнозу меланоми, але, схоже, комбінація панелі експресії білка, що включає циклін D1, р21, остеонектин (SPARC), ПКК α, Ki-67, topoII α та сурвівін може мати велике діагностичне використання для диференціації типового невуса шпіца від його злоякісних міметиків. Суттєво різне вираження, яке спостерігається у невусах Шпіца та меланомах для деяких білків, вказувало б на використання множинної панелі експресії маркерів у диференціальному діагнозі (Таблиця 3). Зокрема, вища експресія цикліну D1, p21, остеонектину (SPARC) і PKC α, і нижча експресія Ki-67, topoII α та сурвівіну тісно пов’язані з доброякісною поведінкою.
Підводячи підсумок, ми продемонстрували можливість того, що рутинна техніка, така як імуногістохімія, може допомогти відрізнити невус Шпіца від меланоми. Однак більш масштабні дослідження, що включають атипові пухлини шпіца, ураження, що відхиляються від типового вигляду невусів шпіца і мають невизначену біологічну поведінку 7 при тривалому спостереженні, та шпітоїдні меланоми, мабуть, є обов’язковими для підтвердження та побудови корисної та цінної групи експресія маркера в класифікації меланоцитарних уражень.