Для:
Хуан Карлос Медіна Б.
Еліезер Кастільо
Вступ
Мікотоксини - це вторинні низькомолекулярні метаболіти, що виробляються грибами, що викликають патологічні ефекти у людей та тварин.
14.2. Розробка імунохімічних методів
Оскільки мікотоксини не є антигенними, перші дослідження, які були розроблені, полягали у досягненні кон'югації з білками або поліпептидами, які могли б служити транспортерами в оптимальних умовах для виробництва антитіл у кроликів та інших тварин. З розвитком технологій були вироблені моноклональні антитіла проти різних мікотоксинів. Цей розвиток зростав за останні 8 років. У таблиці 14.1. представлено поточне співвідношення доступних антитіл до мікотоксину.
Як і слід було очікувати, були розроблені різні типи імуноаналізів, серед яких виділяються колони ІФА (імуноферментні аналізи), РІА (радіоімуноаналізи) та імуноафінні колонки. Більшість із цих методів дуже чутливі, специфічні та прості в експлуатації. З якими з’явилися аспекти щодо методології аналізу мікотоксинів.
Перш ніж перейти до обговорення різних типів імуноаналізів, ми повинні врахувати наступне:
Оскільки більшість імуноаналізів засновані на конкуренції за сайти зв'язування молекул антитіл між токсинами, наявними у зразку, та міченими токсинами, характерними для системи, кон'югованими мікотоксинами. Тому в системі аналізу на додаток до специфічного антитіла необхідно мати ідеально мічений мікотоксин.
Необхідно мати хороший метод вилучення мікотоксинів та відповідну процедуру поділу зв’язаних та вільних токсинів.
Потрібно знати ступінь специфічності антитіл, що зшиваються, щодо аналогічних сполук.
Оскільки завжди існує ймовірність того, що якийсь компонент зразка реагує з антитілами, необхідно детально вивчити кожен тип матриці, перш ніж проводити відповідні тести.
Процедури очищення екстрактів не потрібно проводити в більшості систем імунологічного аналізу. Таким чином, що екстракт з твердої матриці може бути використаний безпосередньо в тесті, після розведення буферним розчином, характерним для самої системи. Однак чутливість визначень підвищується, коли використовується адекватна процедура очищення екстрактів.
| Афлатоксини: B1, B2, G1 | Мій P |
| Метаболіти афлатоксину B2a, Q1, M1, Ro | Мій P |
| Циклопіазонова кислота | P |
| Ерготамін | P |
| Фузарохроманон | P |
| Фумонізин | М |
| Койєва кислота | P |
| Охратоксин А | Мій P |
| PR-токсин | P |
| Рубратоксин В | P |
| Секалонова кислота | P |
| Стеригматоцистин | P |
| Трихотецени: DAS, DON, FX, DOVE, NIV, T-2 та їх метаболіти | Мій P |
| Зеараленон | Мій P |
| Патулін | P |
Джерело: Чу, 1992 рік.
14.2.1 Радіоімуноаналізи (RIA)
Процедура радіоімунологічного дослідження включає інкубацію конкретного антитіла одночасно з розчином зразка або стандартним розчином відомої концентрації та постійною кількістю міченого токсину. Після поділу вільних та зв’язаних токсинів у кожній із цих фракцій визначають радіоактивність.
Концентрацію токсину у зразку визначають, порівнюючи із стандартною кривою, яка встановлюється шляхом побудови співвідношення радіоактивності у зв’язаній фракції та вільної фракції щодо логарифму концентрації немічених токсинів.
Чутливість цього типу аналізу на мікотоксини узагальнена в таблиці 14.2, але загалом цей імуноаналіз може виявити від 0,25 до 0,5 нг очищеного токсину. У випадку зразків їжі межі виявлення становлять від 2 до 5 ppb. Цю чутливість можна покращити за допомогою певної процедури очищення екстрактів або за допомогою радіоактивних маркерів високої активності, таких як мікотоксини, мічені 125 I. Хоча ця методика є інструментом, що забезпечує точні результати, метод передбачає використання радіоактивності, отже він використовується виключно в дослідницьких лабораторіях та на деяких промислових об'єктах.
| AFB/AF | Кукурудза, пшениця, арахіс | 1 - 10 |
| Афлатоксин М | Молоко | 0,01 |
| Дезоксиніваленол | Кукурудза, пшениця | 300 |
| Охратоксин А | Кукурудза, пшениця | 5 |
| Токсин Т - 2 | Кукурудза, пшениця | 2,5 - 50 |
| Зеараленон | Кукурудза | 100 |
Джерело: Чу, 1992 рік
14.2.2 Конкурентні імунологічні аналізи (ІФА)
Загалом, система ІФА приблизно в 10-100 разів більш чутлива, ніж радіоімуноаналізи для очищених мікотоксинів. Можливість виявлення значень до 2,5 пг чистих мікотоксинів.
Сучасний розвиток цих ІФА дозволяє визначати афлатоксин, токсин Т-2 або дезоксиніваленол менш ніж за одну годину після процесу екстракції. Чутливість системи ІФА покращується, коли виконуються процеси очищення екстракту. Чутливість систем ІФА специфічна для кожного мікотоксину, таблиця 14.2. представляє стосунки щодо цієї інформації.
У непрямому аналізі ІФА кон’югат, утворений мікотоксином, зв’язаним з білком або поліпептидом, іммобілізується на мікротитраційній пластині. Пластина інкубується зі специфічним антитілом у присутності та відсутність гомологічних мікотоксинів. Потім кількість антитіла, зв’язаного з білковим кон’югатом, іммобілізованим на пластині, визначається за допомогою реакції з ферментним комплексом IgG, який є у продажу, та подальшої реакції з субстратом. Таким чином, токсин у зразках та токсин у твердій фазі конкурують за однакові ділянки зв'язування зі специфічним антитілом у розчині.
Серед недоліків цієї системи - час отримання результатів, від 2 до 3 годин, та проблеми її використання. Тому ці випробування потребують набагато більшого управління та спеціалізації, саме тому вони проводяться лише в дослідницьких лабораторіях.
Прямі конкурентні тести доступні у продажу, на сьогоднішній день основними системами є: Aflatest, Aflacen (Куба), Biocode (Англія), Transia (Франція) та системи виробництва Німеччини та Японії.
14.2.3 Швидкі якісні тести
Прагнучи отримати якісну інформацію дуже швидко, можна використовувати прямі або непрямі системи ІФА, які вимагають коротших періодів інкубації, в яких була відрегульована концентрація антитіл. В основному розроблені системи, в яких антитіла іммобілізовані на паперовому фільтрі або на мембрані, яка встановлена або на пластиковій картці (тест на екрані картки), у пластиковій чашці (тест на чашку, Cite) або на шприці (Cite зонд) (Dorner and Cole, 1990, Trucksess та ін., 1990, Чу 1990, Стабблфілд, 1988). Реакцію проводять на зволоженій мембрані. Після реакції відсутність або зменшення кольору, як правило, синього, на місці, де був поміщений зразок, вказує на наявність токсину у зразку. Реакція проводиться дуже швидко приблизно від 10 до 15 хвилин.
14.2.4 Імуноафінні стовпці
Інша методика імуноаналізу передбачає використання колонки імуноафінності. У цій процедурі моноклональні антитіла, специфічні для певного мікотоксину, іммобілізуються, утворюючи гель, який упаковують у колонку. Коли екстракт введеного продукту або готової їжі пропускається через колонку, мікотоксин поєднується з ділянками зв'язування антитіла, тоді як решта компонентів екстракту не поєднуються, ми приступаємо до усунення будь-якої сполуки, яка має мікотоксин потім елююється метанольним розчином. Отриманий розчин або пропускають через систему рідинної хроматографії, або дериватизують і зчитують на спеціально розробленому флюорометрі. Існує лише два виробники цього типу колонок Vicam (США) та Biocode (Англія).
14.3. E оцінка імунохімічних аналізів
Результати, отримані на сьогодні на різних системах ІФА, суперечливі, і в руках експертів існує справжня кореляція порівняно з методами тонкошарової хроматографії і навіть з високоефективною рідинною хроматографією (Trucksess та ін., 1990, Парк та ін., 1989 а і б, Медіна та ін., 1990), хоча, коли проводяться спільні дослідження з людьми, які є фахівцями в галузі аналітичної хімії, але без повного засвоєння знань про основи процесу, результати не такі точні (Дорнер та ін., 1993).
| Кукурудза | 5 | 22/26 | 4/26 |
| Кукурудза | 26 | 9/25 | 16/25 |
| Готова їжа | 4 | 17/26 | 9/26 |
| Готова їжа | 14 | 6/26 | 20/26 |
Джерело: Парк та ін., 1989 рік.
У 1990 р. Міністерство сільського господарства США провело оцінку між системами ELISA та колоною під назвою Holaday-Velazco, прийнятою міжнародним AOAC як офіційний метод якісних випробувань (Koeltzow and Tanner, 1990).
| Кукурудза c.nat. | 24/24 | 24/24 | 146 | 140 | 101 |
| 30 | 24/24 | 22/24 | 27 | 26 | 29 |
| двадцять | 24/24 | 18/24 | 19 | 18 | двадцять один |
| 10 | 24/24 | 16/24 | 7 | 8 | одинадцять |
| 0 | 24/24 | 24/24 | 1 | 1 | 0 |
| Бал їжа. | |||||
| 30 | 24/24 | 20/24 | 27 | 17 | одинадцять |
| двадцять | 12/24 | 11/24 | 8 | 6 | 7 |
| 10 | 24/24 | 23/24 | 4 | 4 | 5 |
| 0 | 24/24 | 24/24 | 0 | 0 | Таблиця 14.5. Порівняння результатів між імуноаналізами та колоною Холадея Веласко для визначення афлатоксинів |
| ІФА No 1 | І | М | І | ||
| Імуноафінність | І | І | І | ||
| ІФА №2 (видно) | Р. | Р. | Р. | ||
| ІФА №2 (зчитувач) | Р. | Р. | Р. | ||
| ІФА № 3 (картка) | І | І | І | ||
| ІФА No 4 | І | І | І | ||
| SAM-A колонка | І | І | І |
Джерело: Koeltzow та ін., 1990 рік.
| 62 ppb | 100 |
| 24 ppb | п'ятдесят |
| 2 ppb | 100 |
| Штучне забруднення n = 24 | % звернень |
| 40 ppb | 83,7 |
| 24,5 ppb | п'ятдесят |
| 1 ppb | 100 |
Джерело: Медіна та ін., 1990 рік.
| 0,0 | 4.7 | 2.0 | 0–0 | 0–346 | 0–220 |
| 13.1 | 10.7 | 12,0 | 12–14 | 1–29 | 0–81 |
| 28.1 | 19.7 | 20.2 | 24–30 | 0–33 | 0–62 |
| 78,9 | 43.1 | 45.3 | 70–95 | 28-101 | 2–75 |
| 211.4 | 178,9 | 125,9 | 196–238 | 12–400 | 34–440 |
| 303,8 | 139,8 | 160.4 | 263–323 | 80–204 | 76–270 |
Джерело: Дорнер та ін., 1993 рік.
| 0 | 2.4 | 0 | 0 |
| 10 | 8,0 | 8.6 | 10.2 |
| п'ятдесят | 44.4 | 48.4 | 50,6 |
| 150 | 143,5 | 136,0 | 144.4 |
| 300 | 303,0 | 282,0 | 316.2 |
| 400 | 422.4 | 376,0 | 416,0 |
Джерело: Neogen, 1992. Середні результати 5 визначень.
14.4. З висновків
Аналіз мікотоксинів дуже складний, оскільки він присутній у кількості нг/г (ppb), особливо в готовій їжі. Однак за останні 8 років спостерігається дуже помітний розвиток у застосуванні імунохімічних тестів. Ці методи дали змогу спростити аналітичні процеси таким чином, що вони здійснили революцію з точки зору аналітичних засобів. Іншим аспектом є факт наявності на ринку більш чутливих та універсальних приладів. Таким чином, що імуноаналізи представляли альтернативу, хоча не можна вважати, що ці системи вже повністю вдосконалені. Однак ці досягнення в галузі аналітичної хімії настільки цінні, що нагороду міжнародного AOAC у 1993 р. Було присуджено доктору Пестці Дж. Дж., Одному з піонерів у цій галузі. Нарешті, вважається, що ціни, як правило, падатимуть із збільшенням кількості комерційних брендів.
14.5. Бібліографія
Чу, Ф.С. Імуноаналіз на мікотоксини, сучасний стан техніки, комерційне та епідеміологічне застосування. Ветеринар. Токсиксол людини. 32 (доповнення): 42, 1990.
Чу, Ф.С. Останній прогрес аналітичних методів для мікотоксинів у кормах. J. Anim. Наук: 70, 3950–3963, 1992.
Чу, Ф.С., Trucksess, M.W. та Парк, Д.Л. Оцінка імуноферментного аналізу для тонкошарової хроматографії афлатоксину В1 кукурудзи, арахісу та арахісового масла. Доц. Вимкнено Анальний Chem. 71: 126, 1989.
Дорнер, Дж. і Коул, Р. Порівняння двох скринінгових тестів ІФА з рідинною хроматографією для визначення афлатоксинів у сировинному арахісі. Доц. Вимкнено Анальний Chem. 72: 962, 1989.
Кельцов, Д.Е. та Таннер, С. Порівняльна оцінка комерційно доступних методів тестування на афлатоксини. Доц. Вимкнено Анальний Chem. 73: 584, 1990.
Медіна, Дж. та Ромеро, М. Порівняння одного скринінгового тесту ІФА з рідинною хроматографією для визначення афлатоксину В1 у сорго. Тези 104-ї щорічної міжнародної зустрічі Асоціації офіційних аналітичних хіміків. 1990 рік.
Неоген. Технічна інформація про Veratox та Agri-Screen. 1992 рік.
- КОНТРОЛЬ ЯКОСТІ АКВАКУЛЬТУРНИХ ВХОДІВ І ДІЄТ
- Протистояння приходить до грошей, які стягуються за дієти та контроль за субсидіями
- Лікарня посилює контроль якості завдяки 270 дієтам, що подаються в Ідеальний день
- Метаболічний контроль цукрового діабету стосовно якості медичних записів -
- Метаболічний контроль цукрового діабету стосовно якості медичних записів -