предметів
реферат
Протокова аденокарцинома підшлункової залози (PDAC) є четвертою провідною причиною смерті від раку в США, що становить приблизно 40 000 смертей на рік. Нейтральний прогноз PDAC значною мірою обумовлений пізньою діагностикою. В даний час найбільш чутливий діагноз PDAC вимагає інвазивних процедур, таких як ендоскопічна ультрасонографія, яка має власні ризики та точність, що дуже залежить від оператора. Тут ми використали загальні характеристики солідних пухлин, кислого мікросередовища, яке утворюється як побічний продукт метаболізму, для розробки нового підходу до використання вбудованих пептидів з рН (низьким) (pHLIP) для візуалізації PDAC. Ми показали, що флуоресцентно мічений pHLIP може локалізувати та конкретно виявити PDAC у людських ксенотрансплантатах, а також ураження PDAC та PanIN у генетично модифікованих моделях мишей. Цей новий підхід може покращити виявлення, диференціальну діагностику та поетапність PDAC.
Приблизно у 45 000 американців щорічно діагностується протокова аденокарцинома підшлункової залози (PDAC), а захворюваність PDAC зростає 1. Однак з 1970-х років щодо результатів пацієнтів з PDAC було досягнуто незначного прогресу. Основою терапії є хірургічна резекція; однак лише 20% пацієнтів мають право на резекцію через наявність запущеного захворювання на момент постановки діагнозу 2. Відсутність специфічних симптомів (через фізичне розташування органу) та відсутність чутливих та специфічних біомаркерів ускладнює отримання діагнозу на ранній стадії 3. З цих причин існує гостра необхідність у інструментах, які допоможуть у ранньому та конкретному виявленні PDAC перед розвитком мікрометастатичної хвороби. На сьогодні найбільш часто використовувані методи діагностики PDAC, включаючи комп’ютерну томографію (КТ), магнітно-резонансну томографію (МРТ) та ендоскопічну ультрасонографію (EUS), не здатні виявити ранні ураження і в основному використовуються на стадії захворювання 3, 4 .
У цьому дослідженні замість того, щоб використовувати традиційну стратегію молекулярного націлювання, засновану на зображенні одного білка біомаркера, надмірно вираженого в підмножині ракових клітин, ми оцінили більш загальний підхід до націлювання: кислотність мікросередовища пухлини. Ацидоз утворюється як побічний продукт метаболізму ракових клітин і корелює з розвитком та прогресуванням пухлини 5, 6, 7. Візуалізація кислого мікросередовища дозволяє уникнути поширеної проблеми неоднорідності білкових біомаркерів, що обмежує корисність агентів, націлених на конкретні маркери клітинної поверхні 8, 9. Ми використовували нещодавно розроблені чутливі до рН зонди, рН (низький) вставні пептиди (pHLIPs®) для зображення PDAC у мишей. PHLIP - це водорозчинні мембранні пептиди, які вставляються в ліпідний бішар мембран і утворюють трансмембранну спіраль лише в кислому позаклітинному мікросередовищі, як у пухлинах 10, 11, 12, 13. Ми показали, що флуоресцентно мічені зонди pHLIP виявляли пухлини PDAC, метастази та ураження PanIN у доклінічних моделях PDAC на мишах. Отримані дані забезпечують критичне підтвердження принципу, що підтримує подальший розвиток цього нового підходу, що в кінцевому підсумку призведе до клінічного прориву для раннього виявлення та діагностики PDAC.
результат
Метою нашого дослідження є продемонструвати можливість позаклітинної кислотності для візуалізації PDAC на різних моделях пухлини. Для досягнення цієї мети ми використовували чутливий до рН пептид WT-pHLIP та його контроль, 2K-WT-pHLIP (таблиця 1), які були добре перевірені на інших моделях пухлин 13, 14, 15, 16, 17. Залишки протону Asp у трансмембранній частині 2K-WT-pHLIP замінюються позитивно зарядженими непрототованими залишками Lys, що зменшує залежність рН здатності 2K-WT-pHLIP проникати в мембрану. Крім того, ми досліджували націлювання PDAC з варіантами pHLIP, Var3 та Var7 (див. Таблицю 1), оскільки нещодавно вони були визначені як нові варіанти, які дуже підходять для візуалізації кислотної пухлини 12. Всі пептиди містять один залишок Cys для неінтеграції в мембранні кінці (табл. 1), який кон'югували з флуоресцентними барвниками Alexa546 або Alexa647. Конструкції очищали та використовували у дослідженнях флуоресценції in vivo та ex vivo.
Стіл в натуральну величину
pHLIP націлений на PDAC та перитонеальні метастази у ксенотрансплантатах карциноми підшлункової залози людини
Репрезентативні біолюмінесцентні (A) та флуоресцентні (B) зображення атімічних оголених мишей без пухлини (норма, n = 5; ліворуч) та з пухлиною (ортотопічна модель PDAC із міченими люциферазою клітинами Capan-2; n = 5), ін’єкційними 40 мкМ Alexa647 -WT-pHLIP у 100 мкл PBS. Пухлина та нирки позначені чорно-синіми стрілками. Репрезентативні зображення ex vivo нормальної підшлункової залози та PDAC від мишей, яким вводили Alexa647-WT-pHLIP (C). Кількісна оцінка сигналів біолюмінесценції та флуоресценції ex vivo підшлункової залози (n = 5 на групу) (D) та кількісна оцінка сигналу флуоресценції печінки, нирок та легенів (E - G). Значення є середніми ± SEM, * p = 0,0167, ** p = 0,0025.
Повнорозмірне зображення
Дослідження ex vivo підшлункової залози у безпухлинних та безпухлинних мишей показує, що зонд WT-pHLIP спеціально націлений на підшлункову залозу, що несе пухлину, але не на нормальну підшлункову залозу (рис. 1C, D). Сигнал флуоресценції в підшлунковій залозі мишей, що несуть пухлину, був у 13,6 разів вищим (p = 0,0025), ніж флуоресценція в нормальній підшлунковій залозі (Додаткова таблиця 1). Сигнали печінки, нирок та легенів також були кількісно визначені (рис. 1E-G та додаткова таблиця 1). Цікаво, що сигнал у нирці через 24 години після введення WT-pHLIP був значно вищим у мишей, що несуть пухлину, ніж у мишей без пухлини (Фігура 1E). Крім того, щоб визначити, чи можна використовувати ацидоз як маркер для виявлення метастазів, мишам із виявленими метастазами через люмінесцентний сигнал (Малюнок 2А) вводили флуоресцентно мічений WT-pHLIP. Через 24 години введення зонда флуоресценція WT-pHLIP від первинної пухлини та всіх перитонеальних метастазів була локалізована разом із люмінесцентним сигналом (рис.2).
Ортотопічна модель PDAC з міченими люциферазою клітинами Capan-2, ін'єкційними 40 мкМ Alexa647-WT-pHLIP в 100 мкл PBS (+ pHLIP; n = 5) Біолюмінесцентний сигнал, що вказує на ріст пухлини та метастазування (A), ко-локалізується з флуоресцентним сигналом, що демонструє pH-залежне націлювання за допомогою Alexa647-WT-pHLIP (B). Перекриття сигналу відображається на (C).
Повнорозмірне зображення
pHLIP діють у залежності від рН для виявлення PDAC та метастазів у генетично модифікованих моделях мишей (GEMM) та ранніх ураженнях PanIN
GEMM із нормальною підшлунковою залозою (миші без пухлини, n = 10) або PDAC (миші, що несуть пухлини, n = 10) вводили через хвостову вену 40 мкМ Alexa546-WT-pHLIP у 100 мкл PBS (n = 5). ) або 40 мкМ Alexa546-2K-WT-pHLIP (пептидна послідовність, модифікована, щоб бути менш чутливою до рН) у 100 мкл PBS (n = 5). (А) Репрезентативні флуоресцентні зображення ex vivo підшлункової залози, нирок, печінки та легенів безпухлинних мишей (ліворуч) та мишей, що несуть пухлини (праворуч) через 24 години після ін’єкції Alexa546-WT-pHLIP. У деяких мишей спостерігали метастази в печінку (квадрати), які корелювали зі збільшенням сигналу флуоресценції. (B - E) Ex vivo кількісна оцінка безпухлинних мишей (n = 10) та мишей, що несуть пухлину (n = 10), яким вводили Alexa546-WT-pHLIP або Alexa546-2K-WT-pHLIP. (F) Порівняння націлювання на пухлину за допомогою Alexa546-WT-pHLIP та Alexa546-2K-WT-pHLIP (контроль). Значення є середніми ± SEM, * p = 0,0159, ** p = 0,0043.
Повнорозмірне зображення
(A) H&E, флуоресценція сигналу Alexa647 (WT-pHLIP) та DAPI (ядра) безпухлинних мишей (зверху) та мишей, що несуть пухлини (знизу), оброблених 40 мкМ Alexa647-WT-pHLIP у 100 мкл PBS (n = 5). (B) Кількісна оцінка сигналу флуоресценції щодо ядерного фарбування. Значення є середніми ± SEM, **** с
Репрезентативні флуоресцентні зображення ex vivo підшлункової залози (A) та кількісне визначення флуоресценції підшлункової залози (B), нирок (C), печінки (D) та легенів (E) від безпухлинних мишей (n = 10), пухлино- несучих мишей (n = 10), мишей, що містять ураження Паніна (n = 5), і мишей з панкреатитом (n = 5), яким вводили 40 мкМ Alexa647-WT-pHLIP у 100 мкл PBS або 100 мкл PBS. Значення є середніми ± SEM, * с
Коротко, ця робота містить основні доклінічні докази з використанням різних моделей мишей, які спрямовані на кислотність пухлини в підшлунковій залозі за допомогою pH-чутливих зондів pHLIP, можуть бути корисними для клінічного виявлення PDAC. Це відкриває можливість розробити нові клінічні протоколи візуалізації для поліпшення виявлення, звуження диференціальної діагностики та вдосконалення стадії PDAC. Інше використання цього зонда для моніторингу PDAC допоможе покращити виживання, оскільки він зможе виявити більшість пухлин у стадії резектації.
методи
Кон'югація варіантів pHLIP з флуоресцентними барвниками
Варіанти PHLIP були підготовлені твердофазним синтезом пептидів із застосуванням хімії Fmoc (9-флуоренілметилоксикарбоніл) та очищені методом зворотно-фазової хроматографії в лабораторії біотехнологічних ресурсів WM Keck Foundation в Єлі. Кожен варіант pHLIP кон'югували з AlexaFluor®546 та AlexaFluor®647 C5-малеїмідом у ДМСО у співвідношенні 1: 1, 2 барвники: пептид та інкубували при кімнатній температурі протягом 4-8 годин. Хід реакції контролювали за допомогою ВЕРХ із зворотною фазою. Продукти виділяли за допомогою ВЕРХ. Ідентичність піку підтверджена за допомогою мас-спектрометрії SELDI-TOF та аналітичної ВЕРХ. Концентрації кон'югованого пептиду визначали по абсорбції (для Alexa546: ε = 93000 М-1 см-1 та для Alexa647: e = 265000 М-1 см-1).
Клітинні лінії
Встановлена клітинна лінія карциноми підшлункової залози (Capan-2) була отримана з американської колекції типових культур (ATCC, Манассас, штат Вірджинія). Клітини регулярно культивували в рекомендованих середовищах. Усі клітини підтримували при 37 ° C у зволоженій атмосфері 5% CO 2.
імуноцитохімія
Предмети слайдів замороженої тканини покривали за допомогою монтажного середовища VECTASHIELD (Vector laboratories, Burlingame, CA). Зрізи досліджували на мікроскопі Zeiss Axioplan2 і знімали за допомогою камери Hamamatsu ORCA-ER із програмним забезпеченням Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD) та аналізували за допомогою програмного забезпечення Simple PCI (Hamamatsu Corporation, Sewickley, PA).
Тваринні моделі
Щоб оцінити, чи може pHLIP служити біомаркером для візуалізації in vivo, були проведені дослідження імунодефіцитних ксенотрансплантатів карциноми підшлункової залози людини (отриманих від Національного інституту раку у віці від 5 до 6 тижнів) та трансгенних мишей. Тварини були розміщені в онкологічному центрі ім. Всі процедури на тваринах виконувались відповідно до інституційних вказівок Центру раку МД Андерсон (Х'юстон, Техас) з використанням затвердженого ветеринарного протоколу Інституційних комітетів по догляду та використанню тварин при Онкологічному центрі Андерсона Університету Техасу. Мишей, що використовувались для досліджень оптичних зображень, годували дієтою без хлорофілу.
Генетичні моделі мишей PanIN та PDAC були розроблені шляхом схрещування мишей 32 LSL-KRas G12D 32 з флоксифікованими мишами p53 33 та специфічними мишами cre (Pdx-1-Cre) підшлункової залози 34 для отримання мишей, які мали умовний делецію p53 та ендогенних рівнів мутантних KRas G12D18., PDAC у цих мишей розвинувся через 6-8 тижнів після народження 35. Брати та сестри без PDAC служили контролем. Крім того, мишей LSL-KRas G12D 32 схрещували з регульованим CreERT (Ela-CreERT) тамоксифеном (Ela), регульованим еластазою (Ela), як описано вище 36, і годували дієтою з високим вмістом жиру протягом 30 днів, щоб викликати ураження PanIN 1, як було описано вище 19. Миші гена LSL-KRas G12D, p53 та Pdx-1-Cre були отримані з моделей мишей для сховища консорціуму раку людини (Rockville, MD).
Зображення in vivo та ex vivo
Статистичний аналіз
Дані представлені як середнє значення ± SEM. Для досліджень in vivo ми використовували по 5 тварин на групу (n = 5). Статистично значущі відмінності визначали за допомогою двостороннього непарного t-критерію Стьюдента (P