донорів

  • предметів
  • реферат
  • Головний
  • результат
  • Гестаційний MDD змінює морфометричні властивості та властивості мозку щурів
  • MDD зменшує експресію мозку та фосфорилювання Stat3
  • MDD впливає на експресію протеїнкіназ активного ключа
  • Зниження передачі сигналів Stat3 асоціюється із збільшенням апоптозу та супутньою зміненою експресією споріднених білків у природніх умовах aj в пробірці
  • Зниження передачі сигналів Stat3 пов’язане зі збільшенням експресії miR-124 в мозку
  • Заглушення miR-124 посилює передачу сигналів Stat3 і принаймні частково рятує клітини, що зазнали дефіциту фолатів
  • обговорення
  • Додаткова інформація
  • Файли зображень
  • Додаткова фігура 1
  • Додатковий малюнок 2
  • Додатковий малюнок 3
  • Додатковий малюнок 4
  • Документи Word
  • Додаткова легенда зображення
  • глосарій

предметів

  • Стільникова сигналізація
  • Розвиток нервової системи
  • Метилювання ДНК
  • міРНК

реферат

Головний

В експериментальних дослідженнях відсутність донорів метилу, таких як фолат та В12, було пов'язано з незбалансованою проліферацією/диференціацією нейрональних клітин, стресом ендоплазматичного ретикулума та апоптозом. 11, 12, 13, 14, 15 Крім того, у гризунів повідомлялося про атрофію гіпокампа, рідкість мікрососудів та когнітивні порушення. 12, 16, 17 Хоча було доведено, що гомоцистеїн є ембріотоксичним, він, здається, не є безпосередньо відповідальним за порушення розвитку 18, 19, а механізми, що лежать в основі впливу рівня вітаміну В матері на нервову трубку та розвиток мозку, залишаються погано зрозумілий.

Розвиток ембріофетального мозку - це дуже складний процес, який вимагає часової експресії конкретних генних наборів з низкою точно організованих етапів. 20 Щоб визначити, як генетична регуляція факторів нервового розвитку може бути відповідальною за дефекти мозку, пов’язані з виснаженням фолатів/вітаміну В12, ми застосували підхід мікрочипів (нейрогенез щурячих щурів та ПЛР-масив нервових стовбурових клітин, RT 2 Profiler PCR Array, SABiosciences, Qiagen SA .). Оскільки перетворювач сигналу та активатор транскрипції 3 (Stat3) з’явився як єдиний ген, сильно знижений для дефіциту вітаміну В, ми далі досліджували його участь у наслідках MDD in vivo на підтвердженій моделі 12, 17 та in vitro гіпокампа-щурів . 14

Stat3, в основному асоційований із сигналами, пов'язаними з цитокінами та факторами росту, активується фосфорилюванням та регулює транскрипцію генів-мішеней, які беруть участь у багатьох фізіологічних реакціях. Дійсно, Stat3 неодноразово брав участь у основних біологічних процесах, таких як проліферація, диференціація, апоптоз та виживання клітин, 22, 23, і було показано, що він бере участь у різних подіях розвитку, таких як зв'язування та провідність рухових нейронів 24 та розростання невритів., 25 Ось перший доказ того, що рання МРЗ викликає втрату передачі сигналів Stat3, пов’язану з надмірною експресією miR-124, із порушенням розвитку мозку.

результат

Попередні дослідження in vivo та in vitro продемонстрували ефективність наших експериментальних умов щодо зменшення доступності донора метилу у нащадків щурів 12, 26 та клітин H19-7 гіпокампа. 14 В обох експериментальних моделях глобальне метилювання ДНК було зменшено в умовах експерименту з низьким вмістом метилового спирту, тобто на 23,2% у тканині головного мозку плода (n = 4) та на 40,4% у культивованих клітинах гіпокампа через 13 годин після індукції їх диференціації ( n = 4).

Гестаційний MDD змінює морфометричні властивості та властивості мозку щурів

Як показано на малюнку 1, маса тіла та довжина тіла були значно зменшені (-20,5% та -15%) під час пізньої вагітності (ембріональний день 20, E20) у фетальних щурів, яких годували дієтами, на що вказує поява внутрішньоутробної відсталості. Це було підтверджено значним зменшенням довжини стегнової кістки (-14%). Хоча вага мозку також була порушена (-14,6%), товщина селективних шарів мозку, таких як пірамідальний шар гіпокампа СА1, шар клітин гранул зубної звивини та нейрогенна субвентрикулярна зона (-40, -22% та -26% ) було різко зменшено.%). Найцікавіше, однак, що ці ділянки мозку залишались атрофованими у віці 450 днів, хоча щенята щурів отримували лише стандартну, дефіцитну дієту після відлучення (малюнки 1e-h).

Вплив дефіциту донора метилу на морфометричні властивості плоду щура. a - d ) Загальні морфометричні вимірювання у контрольних та плодів MDD у день ембріона (ED) 20, 33≤ n ≤37. Дані представлені як середнє значення ± SD Статистично значущі відмінності між контрольними та MDD щурами: ** P 705 та фосфо-Stat3 Ser 727 (рис. 2b). Кількісні зміни рівня білка наведені в додатковій інформації (додатковий малюнок 1). Згідно з нашими Вестерн-блот-аналізами, загальна кількість білка Stat3 була зменшена на 62% у позбавленому плоду середньому мозку. Як показано на малюнку 2c для фосфо-Stat3 Tyr 705, такі спостереження були підтверджені імуногістохімією in situ в корі головного мозку, в SVZ та в шарі CA1 гіпокампу.

Вплив дефіциту донора метилу на експресію мозку Stat3 та фосфо-Stat3 (Tyr 705 та Ser 727) у плодів щурів при E20. a ) Загальний рівень мРНК Stat3, виміряний за допомогою кількісної RT-PCR у реальному часі. Дані подаються у довільних одиницях (AU) як середнє значення ± SD (n = 5), * P 705 та фосфо-Stat3 Ser 727 у середньому мозку та корі від контрольних плодів (C) та MDD E20. Подібні профілі були отримані в ході ще п'яти експериментів. c ) Імуногістохімічне фарбування Stat3 та фосфо-Stat3 Tyr 705 у корі головного мозку, SVZ та шарі гіпокампа CA1 від плодів контролю та MDD E20

Повнорозмірне зображення

Подібні висновки були отримані в культивованих клітинах-попередниках гіпокампа зі зниженим рівнем мРНК (-54%) та експресією білка через 6 та 13 годин після індукції диференціації у вільних від фолатів клітинах (рисунок 3 та додатковий малюнок 1). Кількість загального білка Stat3 зменшилась на 48% через 13 годин після індукції диференціювання клітин. Крім того, імуноцитохімічні аналізи за допомогою конфокальної мікроскопії виявили очевидне зменшення присутності Stat3 в ядрах клітин (рис. 3в).

Вплив дефіциту фолієвої кислоти на експресію Stat3 та фосфо-Stat3 (Tyr 705 та Ser 727) у клітинах-попередниках гіпокампа H19-7. a ) Загальний рівень мРНК Stat3, виміряний за допомогою кількісної RT-PCR у реальному часі в контрольних та В9-дефіцитних клітинах через 13 годин після індукції їх диференціації. Дані повідомляються в AU як середнє значення ± SD (n = 5), * P 705 та фосфо-Stat3 Ser 727 у контрольних (C) та дефіцитних B9 (D) клітинах H19-7 через 6 та 13 годин після індукції диференціації. були отримані в результаті ще п’яти експериментів. c ) Імуноцитохімічне мічення Stat3, фосфо-Stat3 Tyr 705 та фосфо-Stat3 Ser 727 у контрольних клітинах та В9-дефіцитних клітинах H19-7 через 13 годин після індукції їх диференціації

Повнорозмірне зображення

MDD впливає на експресію протеїнкіназ активного ключа

Сигнальні шляхи Stat3 вимагають декількох кіназ, таких як Erk1/2 MAP кінази, p38, c-Jun N-кінцева кіназа (JNK) та Src, які беруть участь у димеризації та активації Stat3. 27, 28

Після впливу MDD на схеми експресії активних фосфорильованих форм відповідних кіназ по-різному впливали (рис. 4). Рівні експресії фосфо-Erkl/2, фосфо-Src та фосфо-р38 суттєво знизились, тоді як експресія фосфо-JNK зросла, а експресія фосфо-Акт не зазнала значних змін. Важливо, що зареєстровані профілі були подібними в тканинах головного мозку плода та в диференціації клітин H19-7. Кількісні зміни кількості білка наведені в додатковій інформації (додаткова фігура 2).

Вестерн-блот-аналіз фосфо-кіназ, що перебувають за течією, задіяних у сигнальних шляхах Stat3 у корі головного мозку контрольних (C) та плодів MDD E20 та у клітинах (C) та дефіцитних B9 (D) H19-7 через 6 та 13 годин після індукції їх диференціації. Подібні профілі були отримані в ході ще п'яти експериментів

Повнорозмірне зображення

Зниження передачі сигналів Stat3 пов’язане із збільшенням апоптозу та супутньою зміненою експресією споріднених білків in vivo та in vitro

Відомо, що активація Stat3 позитивно впливає на експресію антиапоптотичних та Bcl-2 та Bcl-xL білків виживання. 29, 30 Тому ми дослідили рівні їх експресії, а також рівні інших ключових факторів апоптозу після МДД.

Як і слід було очікувати, кількість Bcl-2 і Bcl-xL значно зменшилося в мозку плодів Е20, які харчуються погано, а рівні експресії проапоптотичних білків Bax та розщепленої каспази-3 зростали як у середньому мозку, так і в мозку. кора, розщеплена каспаза-9, надмірно експресується лише в середині мозку (рис. 5а). Кількісні зміни кількості білка наводяться в додатковій інформації (додатковий малюнок 2). Крім того, кількість TUNEL-позитивних клітин в гіпокампі, SVZ та корі головного мозку дефіцитних плодів суттєво зросла (рис. 5c, додаткова фігура 3). Це було підтверджено маркуванням активних каспаз-3 і каспаз-9 у головному мозку плода, як показано в області гіпокампа CA1 та у SVZ, з наявністю великої кількості мертвих клітин у бічному шлуночку (додаткова фігура 3 ).,

У дослідженні з використанням TaqMan RT-qPCR, моделі експресії nCRNA miR-124a показали значне збільшення (у два рази) в мозку підданих MDD плодів E20, а також у B9-дефіцитних нейропрогеніторах H19-7 через 13 годин після індукції. їх диференціація (в 1,7 рази) (рисунки 6а). Це було підтверджено гібридизацією in situ у природних умовах у різних регіонах мозку, включаючи гіпокамп, SVZ (рис. 6c) та мозочок (не показано) та in vitro в клітинах диференціювання (рис. 6d).

Вплив дефіциту донора метилу на експресію miR-124. a ) Рівні експресії miR-124 в АС у мозку контрольних та дефіцитних E20 плодів. ( b ) Рівні експресії в контрольних (C) та B9-дефіцитних (D) клітинах H19-7 через 13 годин після індукції їх диференціації. Усі дані представлені як середнє значення ± SD (n = 9 та n = 7 для тканин мозку E20 та культивованих клітин H19-7), * P ** P

Вплив мовчання miR-124 на диференціацію клітин H19-7. ( a ) Вплив miR-124 siRNA на рівні експресії Stat3 та споріднених білків у контрольних (C) та фолієво-дефіцитних (D) клітинах через 13 годин після індукції диференціювання (si = нецільова siRNA, siM = miR-124-цільова siRNA) . Схеми експресії представляють три окремі серії вестерн-плям. ( b ) Вплив miR-124 siRNA на морфологію клітин через 13 годин після індукції диференціації. ( c ) Відсоток апоптотичних клітин, як показано в аналізі TUNEL. d ) Кількість клітинних процесів на клітину. Для ( c ) a ( d ): статистично значуща різниця з відповідним контролем: * P •• P 14 У цьому дослідженні зниження регуляції siRNA miR-124 призвело до помітного відновлення цих процесів. Незважаючи на те, що лікування miR-124 siRNA незначно впливало на характеристики клітин у контрольних родоначальниках, кількість невритів на клітину збільшилась у fold рази у фолієво-дефіцитних клітинах, оброблених miR-124 siRNA, порівняно з клітинами, обробленими нецільовою siRNA (Рисунки 7d, P

Короткий зміст основних подій, пов’язаних із наслідками MDD у мозку щурів. Зверніть увагу, що ми надаємо перші докази зниження регуляції за допомогою miR-124 щодо активності Src, що представляє собою фосфорилювання Stat3 у залишку Tyr 705.

Повнорозмірне зображення

Прямий вплив MDD на метаболізм одиночного вуглецю та його різні ключові фактори на тваринній моделі, а також ефекти дефіциту фолієвої кислоти на культивованих предків гіпокампа H19-7 були детально описані в попередніх звітах. 12, 14, 26 Таке лікування, зокрема, призводить до накопичення гомоцистеїну та зменшення клітинного індексу здатності до метилювання, що відповідає співвідношенню SAM/SAH. Це відображається в нашому дослідженні, зокрема у зменшенні кількості метильованої ДНК у відповідь на MDD у наших двох експериментальних моделях.

На диво, хоча лікування siR miR-124a siRNA трохи зменшило кількість невритів у контрольних клітинах, це значно покращило морфологію клітин у дефіцитних родоначальників.

Хоча точні механізми, за допомогою яких статус вітаміну В може впливати на експресію miR-124, все ще повністю з'ясовані, існування зв'язку між фолатом та miR вже було задокументовано. Добавки фолатів мали б сприятливий вплив на тератогенез, спричинений етанолом, у мозку плода, частково знижуючи регуляцію miR-10a, 43, одночасно експресію різних miR у мозку, що розвивається, у моделі мутантної миші нервової трубки (Splotch -/- ) була змінена за допомогою добавок фолієвої кислоти. 44 Нарешті, Marsit та ін. 45 показали, що дефіцит фолієвої кислоти спричинив значне збільшення профілів експресії декількох miR у культивованих клітинах лімфобластоїдів людини. Зниження статусу фолієвої кислоти/вітаміну В12 призводить до зниження доступності SAM, що потрібно для реакцій клітинного метилювання. Було задокументовано, що MiR регулюються епігенетичними подіями, і нещодавно було продемонстровано метилювання-опосередковане мовчання генів miR-124. 47 Отже, змінена експресія miR-124 може бути пов’язана з надходженням донорів з низьким вмістом метильних груп, поряд зі зниженим метилюванням ДНК, як це спостерігається у наших моделях, і в кінцевому рахунку призвести до змін у експресії Stat3.

На закінчення ми показали, що MDD асоціюється із підвищеною експресією miR-124, що впливає на сигналізацію Stat3 на двох різних рівнях; по-перше, на рівні експресії, націлюючись на мРНК Stat3, а по-друге, націлюючи на її активацію шляхом інгібування кіназ Erk1/2 та Src, без впливу miR-124 на інші кінази, що беруть участь у передачі сигналів Stat3. Мозок дуже вразливий під час розвитку, а порушена передача сигналів Stat3 може призвести до зменшення проліферації клітин та посилення апоптозу, що може призвести до остаточної атрофії конкретних шарів мозку, як це спостерігається у щурів з дефіцитом вітаміну B.