жиру

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Зміни слизової оболонки товстої кишки після зміни дієти
  • Зміни мікробного обміну товстої кишки після зміни дієти
  • Глобальні зміни обміну речовин після зміни дієти
  • Глобальні асоціації мікробів і метаболітів
  • Дієта з низьким вмістом клітковини та токсичні мікробні метаболіти з високим вмістом жиру
  • обговорення
  • методи
  • Вивчати дизайн
  • Предмети та вербування
  • проекція
  • Відповідність предмету
  • Відбір проб калу, товстої кишки та слизової оболонки та колоноскопія
  • Вимірювання біомаркерів слизової оболонки
  • імуногістохімія
  • Кількісна оцінка імуногістохімічного фарбування
  • Кі67
  • CD3
  • CD68
  • Цілеспрямований аналіз калових та товстокишкових мікробів та метаболітів, що становлять особливий інтерес
  • Амінокислоти плазми
  • Статистичний аналіз
  • Глобальний аналіз складу та різноманітності мікробіоти
  • Аналіз HITChip
  • Аналіз мережі спільного виникнення мікробів
  • Глобальний аналіз метаболому: підготовка зразка для ЯМР-спектроскопічного аналізу
  • 1 H ЯМР-спектроскопія
  • Багатовимірний статистичний аналіз даних
  • Генерація мережі метаболічних реакцій
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

  • Рак товстої кишки
  • епідеміологія
  • Харчування
  • Фактори ризику

реферат

З результатів двох нещодавно опублікованих досліджень на людях ми знаємо, що модифікація вмісту клітковини та жиру в раціоні має значний вплив на мікробіоти в товстій кишці протягом декількох днів 11, 12. Тут ми надаємо критичну інформацію про функціональне значення цих змін мікробіоти на слизовій оболонці товстої кишки шляхом зміни співвідношення жиру та клітковини у наших двох раках товстої кишки з високим та низьким ризиком. Використовуючи схему дослідження, викладену в таблиці 1, ми продемонстрували очікуване збільшення сахаролітичного бродіння та бутирогенезу та придушення вторинного синтезу жовчних кислот, спричиненого переходом афроамериканців на дієту з високим вмістом клітковини та жиру протягом 2 тижнів, пов'язану з значне зменшення біомаркерів запалення та валової проліферації.ризик кишечника раку. Навпаки, зміна раціону в сільських африканцях на раціон із низьким вмістом клітковини та з низьким вмістом клітковини призвів до оборотних змін у всіх цих параметрах.

Стіл в натуральну величину

результат

Зміни слизової оболонки товстої кишки після зміни дієти

( a ) Огляд суттєво змінених родоподібних бактеріальних груп (FDR 1 до і після їжі і принаймні r |> 0, 5. Позитивні кореляції позначаються зеленими лініями; негативні кореляції - червоними лініями. Ідентично пофарбовані вузли позначають мережеві модулі з трьома або більше одночасно зустрічаються сірі вузли представляють модулі менш ніж з трьох одночасних груп або тих, які не представлені модулем. Обсяг вибірки становить 20 афроамериканців та 17 сільських (корінних) африканців.

Повнорозмірне зображення

Глобальні зміни обміну речовин після зміни дієти

Повнорозмірне зображення

Повнорозмірне зображення

Стіл в натуральну величину

Глобальні асоціації мікробів і метаболітів

Щоб вивчити це, ми провели частковий кореляційний аналіз між мікробами на рівні роду та метаболітами сечі та фекалій (рис. 4b), з урахуванням національності та дієти. Хоча ми не можемо біологічно пояснити всі асоціації (наприклад, пропіонат корелює з ентеробактеріями та стрептококами, які, як відомо, не продукують пропіонат), одна вражаюча особливість полягала в тому, що метаболіт бутирату був пов'язаний виключно з мікробними групами, які, як відомо, містять продуценти пропіонату. Бутират. прикладами є R. intestinalis і rel., E. прямокутник і rel. і C. symbiosum і rel., які показані в мережах співіснування на фіг. 3b збільшити, коли обидві групи населення споживали дієту з високим вмістом клітковини.

Дієта з низьким вмістом клітковини та токсичні мікробні метаболіти з високим вмістом жиру

обговорення

методи

Вивчати дизайн

Предмети та вербування

Здорові добровольці за віком та статтю, віком від 50 до 65 років, були випадковим чином відібрані серед афроамериканського населення в регіоні Пітсбург у штаті Пенсільванія та серед південноафриканських сільських жителів із сільського регіону Квазулу. Ми співпрацювали з доктором Стівеном Томасом, директором досліджень меншин у Школі громадського здоров’я Університету Пітсбурга, з метою набору здорових афроамериканських добровольців з регіону Пітсбург, а також прорекламували дослідження за схваленням нашої Ради з оцінки інституцій у громадських місцях. У Південній Африці добровольців набирали за допомогою реклами, розміщеної в громадських центрах громад, наприклад, поштових відділеннях, ратушах, громадських центрах та через Центр охорони здоров’я громади iZulu. Відповідна компенсація (згідно з рекомендаціями досліджень меншин та громади iZulu та затверджена Університетом Пітсбурга та Квазулу-Натал) за час та тестування була виплачена волонтерам за участь.

проекція

У кожного учасника була взята інформована підписана згода. Усі африканські добровольці могли розуміти англійську мову, але медсестра-перекладач брала участь у процесі згоди, щоб забезпечити належне розуміння деталей дослідницьких процедур. Скринінг проводився в Пітсбурзі в Центрі клінічних трансляційних досліджень та в Африці в амбулаторії лікарні Нгвелецана, Емпангені, Квазулу-Наталь, Південна Африка. Спочатку було взято детальну історію хвороби. З сільськими африканцями місцева двомовна медсестра виступала в ролі перекладача. Для взяття загального аналізу крові, ШОЕ, електролітів та сечовини, альбуміну, лужної фосфатази, АСТ та білірубіну брали 20 мл крові. Якщо результати були нормальними і якщо вони відповідали критеріям прийнятності, їх запрошували взяти участь у дослідженні.

Відповідність предмету

Детальна інформація наведена в додатковій примітці 1. Критерії включення були такими: здорові добровольці, з точки зору шлунково-кишкового тракту від 40 до 65 років (вік, у якому рекомендується проводити скринінг/колоноскопію на рак товстої кишки у цій популяції) та індекс маси тіла від 18 до 35 кг м -2 (Додаткове обговорення). Критерії виключення були такими: учасники доколоноскопії не мали права, якщо вони мали в анамнезі сімейний аденоматозний поліпоз, спадковий неполіпозний рак прямої кишки, запальне захворювання кишечника або інвазивний рак протягом 5 років до зарахування (h/o аденоматозні поліпи прийнятні). Крім того, учасниками, які не мали права на участь, були особи з відомими порушеннями функції нирок, печінки або кровотеч; попередня операція на шлунково-кишковому тракті, що призвела до порушення функції кишечника внаслідок втрати кишечника або зміни анатомії, або будь-якої форми хронічного захворювання шлунково-кишкового тракту, що призвело до порушення функції кишечника, діареї та порушення всмоктування; а також особам, які протягом останніх 12 тижнів вживали антибіотики (додаткове обговорення), а також застосовують стероїди, які зараз хворіють на цукровий діабет Критеріями виключення після колоноскопії були виявлення раніше нерозпізнаних виразок (з глибиною та> 0,5 см), стриктури, важкого запалення та поліпів> 1 см у діаметрі або раку.

Відбір проб калу, товстої кишки та слизової оболонки та колоноскопія

Вимірювання біомаркерів слизової оболонки

Гістологія. Біопсії слизової оболонки товстої кишки отримували методом колоноскопії до та після переключення дієти з трьох різних місць (висхідного, поперечного та низхідного) та зберігали у 10% забуференному формаліні. Пізніше зразки біопсії вбудовували в парафін, а 5-мм зрізи вирізали і фарбували або звичайними гематоксиліном та еозином (H&E), або імуногістохімічними плямами (див. Нижче). Гістологічні результати на зрізах, пофарбованих Н & Е, оцінював один засліплений досвідчений гастроентерологічний гістопатолог (АК). Вимірювання було зосереджено на кількості запальних клітин та еозинофілів у власній пластинці та кількості інтраепітеліальних лімфоцитів. Оцінка ділянки, забарвленої H & E, проводилася, як показано в додатковій таблиці 5а. Було зареєстровано будь-яку патологічну знахідку, таку як наявність паразитичних організмів.

імуногістохімія

Слайди для фарбування CD3 та Ki67 депарафінізували при 60 ° C протягом 2 годин. Для інгібування ендогенної пероксидази предметні стекла попередньо обробляли 3% перекисом водню/метанолом при кімнатній температурі (RT) протягом 10 хв з подальшим вилученням антигену з 0,2% розчином пепсину (P7012, Sigma, 3050 Spruce St, St Louis, MO, США) при 37 ° С протягом 10 хв. Безсироватковий протеїновий блок (X0909, Dako, 6392 Via Real, Carpinteria, CA 93013, США) використовували при RT протягом 10 хв. Слайди осушували та інкубували з первинними антитілами CD3 та Ki67 (A0452, 1: 100, кролячий поліклонал, Dako; MIB-1, 1: 100, мишачий моноклонал, Dako) відповідно при RT протягом 1 години. Вторинне виявлення застосовували за допомогою універсального набору для виявлення полімерів Immpress (MP-7500, Vector Labs, 30 Ingold Road, Burlingame, CA 94010, USA) при RT протягом 30 хв. Слайди фарбували набором підкладки DAB (SK-4100, Vector Labs) протягом 10 хв, а лічильники фарбували за допомогою Шендона гематоксиліну (6765015, Thermo Scientific, 81 Wyman St, Waltham, MA 02451, USA).

Фарбування слайдів для CD68 проводили на слайді Ventana Benchmark Ultra. Депарафінізовані предметні стекла попередньо обробляли з використанням ультра CC1 (950-224, Ventana, 1910 Innovation Park Dr, Tucson, AZ 85755, USA) протягом 24 хв для отримання антигену. Слайди інкубували з первинним антитілом CD68 (M087601, 1: 100, моноклональний миша, Клон PG-M1, Dako,) протягом 32 хв RT. Набір Optivew DAB (760-700, Ventana) був використаний для вторинного виявлення.

Кількісна оцінка імуногістохімічного фарбування

Підрахунок пропорцій позитивних фарбувальних клітин за допомогою світлової мікроскопії зі збільшенням × 400 проводився одним дослідником (КМ) у сліпих умовах. Для оцінки мінливості між спостерігачами випадковим чином було відібрано 40 слайдів і перераховано другим старшим патологоанатомом (АК), що показало збіг 88% для Ki67 + та 80% для щільності CD68 +.

Частка клітин, які мають позитивне фарбування Ki67, підраховували у добре орієнтованих криптах (середнє значення/слайд 8, діапазон 4–14). Швидкість проліферації Ki67 визначали як кількість клітин Ki67 +, поділену на загальну кількість клітин крипти, і виражали у відсотках. Встановлено, що відмінності однакові в загальній крипті та у верхній крипті; отже, тут подаються лише загальні пропорції склепу.

Тільки CD3 +, що забарвлюють інтраепітеліальні лімфоцити, підраховували в репрезентативній зоні щонайменше з 300 епітеліальних клітин. Щільність інтраепітеліальних лімфоцитів виражалася як індекс кількості CD3-позитивних лімфоцитів на 100 епітеліальних клітин.

Кількість CD68-позитивних клітин (макрофагів) у власній пластині підраховували та оцінювали за шкалою від 1 до 3: ступінь 1 (відсутність/рідкісна), ступінь 2 (розсіяні поверхневі колекції) та ступінь 3 (сильна, дифузна або смугова) -подібний інфільтрат у поверхневій пластині власного шару), як показано на рис. 1c.

Цілеспрямований аналіз калових та товстокишкових мікробів та метаболітів, що становлять особливий інтерес

Амінокислоти плазми

Концентрації крові натще вимірювали в екстрагованій плазмі за допомогою зворотно-фазової ВЕРХ дериватизації передколонної фази C-18 (AccQ · Tag Ultra derivatization, Waters, Milford, MA), як описано раніше 5 .

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз групових відмінностей у безперервних змінних проводили за допомогою SPSS 16.0 (SPSS Inc.). Значимість групових відмінностей для нормально розподілених даних оцінювали за допомогою неспарених та парних t-тестів Стьюдента. Непараметричні дані аналізували за допомогою U-тесту Манна - Уітні або Крускала - Уолліса з одностороннім дисперсійним аналізом (ANOVA) за рангами для неспарених даних та тестами Уілкоксона зі знаком для парних даних. Значимість асоціації оцінювали за допомогою тесту рангової кореляції Спірмена. Рівень P 59, 60, 61, 62, оскільки він дозволяє глибоко профілювати філотипи з високою роздільною здатністю, до 98%) 59 і при значно нижчих витратах.

Аналіз HITChip

Аналіз мережі спільного виникнення мікробів

Глобальний аналіз метаболому: підготовка зразка для ЯМР-спектроскопічного аналізу

Усі зразки сечі розморожували при RT і вихровували протягом 10 с. Загалом 400 мкл зразка сечі ретельно змішали з 250 мкл 0,2 М фосфатного натрієвого буфера, що містить 20% D 2 O, рН 7,4, 0,01% 3- (триметилсилилу) - [2, 2, 3, 3-2H 4] натрієва сіль пропіонової кислоти та 3 мМ азид натрію (NaN 3). Суміш спочатку центрифугували при 10000 g протягом 10 хв, а 600 мкл супернатанту переносили в ЯМР-пробірку із зовнішнім діаметром 5 мм. Приблизно 200 мг вологого зразка калу змішували з 600 мкл H 2 O (марка ВЕРХ) у 1,5-мл пробірці Еппендорфа. Потім на суміші проводили цикл 30-с вихрового, 5-хвилинного обробки ультразвуком при 4 ° C і 30-с вихрового змішування, з подальшим центрифугуванням при 10000 g протягом 10 хв. Загалом 400 мкл супернатанту додавали в 1,5-мл пробірку Еппендорфа, що містить 250 мкл згаданого фосфатного натрієвого буфера, перемішували на вортексі та пряли при 10000 г протягом 10 хв. Кількість 600 мкл супернатанту поміщали в ЯМР-пробірку.

1 H ЯМР-спектроскопія

Спектри ЯМР 1Н зразків екстракту води з сечі та фекалій отримували за допомогою спектрометра Bruker 600 МГц (Bruker, Рейнштеттен, Німеччина) при робочій частоті 1 Н 600,13 МГц при температурі 300 К. Послідовність ЯМР-імпульсів (затримка рециркуляції - 90 ° - t 1 -90 ° - tm -90 ° -придбання) і стандартні параметри використовувались для отримання стандартних одновимірних спектральних даних 1 H ЯМР, як описано в Beckonert et al. 67

Багатовимірний статистичний аналіз даних

Генерація мережі метаболічних реакцій

За допомогою вільно доступного програмного забезпечення MetaboNetworks у KEGG було виявлено 19 реакцій, що відбуваються спонтанно або за допомогою ферментів, зв’язаних з геномами людини та/або бактерій. Всі цілі послідовності геномів, перелічені в KEGG, які можуть бути пов'язані з групами бактерій, представленими на HITChip, були включені у створення бази даних, в результаті чого в базу даних було включено загалом 817 геномів бактерій. Потім було використано програмне забезпечення для побудови мережі метаболічних реакцій з найкоротшим шляхом між усіма (фекальними та сечовими) метаболітами, які суттєво відрізняються в будь-якому з різних порівнянь дієти. З цієї „глобальної мережі” було сформовано дві підграми для кожного з двох дієтичних перемикачів з використанням суттєво пов’язаних фекальних метаболітів. Щоб виділити диференційну експресію метаболітів, асоційованих із конкретними шляхами, до графіків додали фонове затінення для позначення різних взаємопов’язаних шляхів (рис. 5a - c). Абревіатури та повні назви цих метаболітів можна знайти в Додатковій таблиці 11.

Додаткова інформація

Файли PDF

Додаткова інформація

Додаткові рисунки 1-6, додаткові таблиці 1-11, додаткове обговорення, додаткові методи та додаткові посилання

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов надання послуг та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте щось образливим або не відповідаєте нашим умовам чи інструкціям, позначте це як невідповідне.