грунтових

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Склад мікробної спільноти
  • Бактеріальне та грибкове α-різноманіття
  • Хімічні властивості та вплив ґрунту на бактеріальні або грибні таксони
  • обговорення
  • методи
  • Точки відбору проб
  • Вилучення ДНК та секвенування Illumina MiSeq
  • Аналіз послідовності на основі OTU
  • Визначення фізико-хімічних властивостей ґрунту
  • Статистичний аналіз
  • Детальніше
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

реферат

Чорний перець (Piper nigrum L.), з сімейства Piperaceae, є багаторічною деревною альпіністською рослиною, що забезпечує комерційний продукт, відомий як "чорний перець" 1, 2. Чорний перець, який вважається "королем спецій", має широкий спектр використання, від простих харчових інгредієнтів до переконливих фармакологічних переваг 3, 4. Рослина має велике економічне значення у багатьох тропічних країнах, а В'єтнам, Індія, Індонезія, Бразилія та Китай є основними виробниками та експортерами чорного перцю 5. Провінція Хайнань, основний виробник і експортер у Китаї, вирощує 22000 га P. nigrum і щорічно виробляє 3,6 × 107 кг сушених спецій, що становить 90% виробництва перцю в Китаї. Це важлива галузь тропічних культур у Китаї, виробництво якої перевищує 15 мільйонів доларів 6 .

Однак наступні монокультурні проблеми є одними з основних гравців, що впливають на продуктивність та якість чорного перцю в Китаї 7, 8. Хоча послідовне культивування є загальним явищем у сільськогосподарському виробництві, воно може спричинити такі проблеми, як погіршення якості ґрунту 9, зниження врожайності сільськогосподарських культур 10 та загострення хвороб рослин, спричинених шкідниками сільськогосподарських культур 11. Що стосується чорного перцю, то довготривала монокультура призводить до поганого зростання, низького врожаю та серйозних захворювань, що серйозно заважає галузі чорного перцю. Існує ряд досліджень щодо наступних монокультурних проблем із чорним перцем, зосереджуючись, зокрема, на якості плодів 12, живленні ґрунту та фізико-хімічних властивостях 13, 14 .

Повільне загнивання/в’янення, гниль стопи фітофтори та нематоди кореневих вузлів - основні захворювання чорного перцю. Ці три типи хвороб зустрічаються і частіше трапляються на полях з монокультурним чорним перцем 5, 7. Повідомляється, що фузаріоз є патогенним грибом чорного перцю повільного зниження/в’янення 5, а Pseudomonas та Bacillus мають антагоністичну дію проти Phy. Капсічі нематода 15 і кореневий вузол 16. Однак змін кількості патогенного гриба Fusarium та бактерій-антагоністів Pseudomonas та Bacillus у грунті чорного перцю з посадковим віком не повідомляється.

Фізико-хімічні властивості ґрунту, зокрема наявність ґрунтового азоту (N) та рН ґрунту, мають великий вплив на склад ґрунтових мікробних спільнот 23, 24. Наше попереднє дослідження повідомляло, що тривала послідовна монокультура чорного перцю призвела до значного зниження рН ґрунту, органічних речовин (ОМ) та ферментативної активності, що призвело до зменшення вмісту бактерій у ґрунті 25. У цьому дослідженні ми зосередили увагу на порівнянні впливу багаторічної послідовної монокультури на склад бактеріальних та грибних угруповань, а також на фізико-хімічні властивості між ґрунтами з ризосферою та неризосферою.

результат

Склад мікробної спільноти

Після фільтрування значень за базовим контролем якості та видалення одиночної оперативної таксономічної одиниці (OTU) з 24 зразків було отримано 1 477 241 послідовності, що містять 9665 бактеріальних OTU. Кількість високоякісних послідовностей на зразок коливалося від 36 084 до 89 822. Класифіковані послідовності у всіх зразках були пов'язані з 25 бактеріальними філами, а інші послідовності були некласифіковані. Домінуючою філою (середня відносна кількість [ARA]> 1%) у всіх зразках були ацидобактерії (23, 41%), протеобактерії (18, 83%), Firmicutes (6, 75%), хлорофлекси (6, 37%), Веррукомікробія (5, 57%), актинобактерії (5, 57%) 3, 91%), планктоміцети (3, 87%), бактероїдети (3, 09%) та гемматімонадетати (1, 09%) (рис. Сла). Крім того, в більшості ґрунтів були присутні нітроспіра, арматімонадете, ціанобактерії та WS3, але з відносно низьким рівнем захворюваності (ARA: 0,1-1%). Ще 12 рідкісних філіїв належали ARA

Відносна кількість основних бактерій ( a ) та грибні ( b ) штами в грунті з ризосферою та нерізосферою у чотирьох послідовних монокультурних ареалах.

Повнорозмірне зображення

Відносна представленість 10 основних бактерій ( a ) та гриби ( b ) у ґрунті ризосфери та неризосфери у чотирьох послідовних монокультурних ареалах. "12 років", "18 років", "28 років" і "38 років" відносяться до чотирьох послідовних монокультурних діапазонів 12, 18, 28 і 38 років.

Повнорозмірне зображення

На рівні роду (рис. 2) у родів GP4 та GP6 були більші RA у ґрунті з ризосферою, ніж у ґрунті без ризосфери, тоді як у інших восьми родів спостерігалась протилежна тенденція. У нерізосферному ґрунті RA Ktedonobacter зменшувався зі збільшенням тривалості посадки; Однак РА інших родів не продемонстрували жодної очевидної тенденції варіацій. Що стосується грибів, то тенденції майже всіх родів у ризосферному ґрунті були подібними до тенденцій у ризосферному ґрунті, за винятком Aspergillus, який зменшився в грунті ризосфери та збільшився у ґрунті, що не містить ризосфери.

Цікаво, що патогенний гриб Fusarium значно збільшився, оскільки час посадки подовжувався як у ризосферних, так і в нерізосферних грунтах. На відміну від них, Pseudomonas та Bacillus, корисні для росту чорного перцю, продемонстрували значне зменшення.

Бактеріальне та грибкове α-різноманіття

Індекси багатства та різноманітності мікробних спільнот наведені в таблиці 1. Охоплення всіх зразків було вище 96%, що вказує на те, що глибина послідовності відповідала потребам наших експериментів. Що стосується грибів, індекс Шеннона виявив значне зниження ґрунтів із ризосферою та без неї, оскільки час посадки було подовжено. Зокрема, різноманітність грибів у ґрунті значно зменшилася після 38 років вирощування чорного перцю. У випадку з бактеріями багатство та різноманітність ґрунтових бактерій зменшувались із часом посадки як у ризосферних, так і в ризосферних ґрунтах, хоча індекси Чао1 та Шеннона не виявили суттєвої різниці.

Стіл в натуральну величину

Хімічні властивості та вплив ґрунту на бактеріальні або грибні таксони

Як показано в таблиці 2, вміст ОМ у ґрунті та наявний вміст К (АК) значно зменшились під час монокультури у ґрунтах ризосфери та ризосфери. Зміни рН обох ґрунтів коливались із тенденцією до зниження. Крім того, наявний вміст N (AN) та доступний P (AP) у ґрунті з ризосферою з часом збільшувався, а значення AP у ґрунті з ризосферою було приблизно в 10 разів вище, ніж у ґрунті без ризосфери.

Стіл в натуральну величину

Тести Монте-Карло, засновані на хімічних властивостях ґрунту та кількості найбільш поширених бактеріальних та грибкових філів, показали, що вибрані хімічні властивості ґрунту суттєво корелювали з варіаціями обраного філу (Р = 0,01). Аналіз надмірності (RDA) показав, що перший та другий компоненти RDA пояснюють 52, 76% та 30, 27% загальних варіацій бактерій та грибків (рис. 3). Для бактерій перший компонент (RDA1), який пояснив 37,57% від загальної варіації, відокремив зразки грунту ризосфери, отримані з чотирьох польових ділянок, з різною тривалістю посадки від зразків ґрунту, що не містить ризосфери. Як показують їх близькі скупчення та переносники, домінуючим штамом бактерій у зразках грунту ризосфери були протеобактерії і асоціювався з вмістом АР, рН та ОМ та АН, тоді як домінуючим штамом бактерій у вільному від ризосфери ґрунті були кислоти. Що стосується грибів, то перший компонент (RDA1), на який припадало 15,65% від загальної варіації філи гриба, відокремив зразки ґрунту віком від 38 років від ризосфери та нерізосферу від інших зразків. Як показали їх тісні угруповання та переносники, найвищим штамом грибів у 38-річному лікуванні був Ascomycota і був пов’язаний із вмістом АН.

Аналіз надмірності (RDA) рясних ґрунтових бактерій ( a ) та грибкові ( b ) фізичні та фізико-хімічні властивості ґрунту для окремих зразків чотирьох послідовних монокультур на полях чорного перцю. "12 років", "18 років", "28 років" і "38 років" відносяться до чотирьох послідовних монокультурних діапазонів 12, 18, 28 і 38 років.

Повнорозмірне зображення

Порядок Спірмена був використаний для оцінки взаємозв'язку між рясними філітами та фізико-хімічними властивостями ґрунту (таблиця S1). Результати показали різні співвідношення ґрунтової мікробної філософії та фізико-хімічних властивостей ґрунту в ґрунтах з ризосферою та нерізосферою. Наприклад, РА ґрунтового мікробного філу без ризосфери негативно корелював (Firmicutes phylum позитивно корелював) з рН ґрунту, але суттєвої кореляції з АР не було. На відміну від цього, у ризосферних ґрунтах не було значної кореляції з рН та позитивної кореляції з АР.

обговорення

У цьому дослідженні аналіз послідовності послідовностей 16S рРНК та ITS Illumina MiSeq показав, що довгострокові послідовні монокопії чорного перцю змінювали структуру грунтової мікробної спільноти. Зміни, що спостерігаються для бактерій, узгоджуються з нашими попередніми результатами, які показують, що ацидобактерії та протеобактерії є основним типом із зменшенням кількості Firmicutes при тривалому безперервному культивуванні 25. У нерососферних ґрунтах ацидобактерії РА суттєво збільшились при безперервному посіві, тоді як Bacteroidetes і Firmicutes зменшились. Зміни цих трьох філоз відповідали попереднім дослідженням наступних культур 26. Що стосується грибів, найпоширенішим штамом була Ascomycota, яка становила 89,92%, і її RA значно збільшувався з часом посадки. У ризосферному ґрунті РА п’яти найважливіших філів поступово зростала. Однак RA Chytridiomycota RA дещо зменшився в грунті з ризосферою, тоді як RA інших чотирьох філів збільшився. Крім того, на 38-річному полі спостерігали значне зниження індексу Шеннона в грунті ризосфери, що свідчить про те, що тривале подальше вирощування може спричинити значне зменшення різноманітності грибів у грунті чорного перцю.

Біологічні властивості ризосферних ґрунтів можуть суттєво відрізнятися від властивостей грунтових ґрунтів 34, і подібне явище спостерігалось у цьому дослідженні. По-перше, середній РА протеобактерій у ризосферному ґрунті (РА 23, 55%) був значно вищим, ніж середній РА у ґрунті без ризосфери (РА 14, 11%). По-друге, RA Firmicutes значно зменшився з 20, 31% (12 років) до 5,37% (38 років) у ґрунті без ризосфери, однак суттєвої різниці в ґрунтовій ризосфері не спостерігалося. Нарешті, на рівні роду РА більшості родів були різними між ризосферними та ризосферними ґрунтами. Ці результати можуть бути зумовлені складною взаємодією між ексудатами коренів, поживними речовинами та ґрунтовими мікроорганізмами35. Крім того, біодоступність поживних речовин у ґрунті та багатство та різноманітність мікробних спільнот були вищими в ґрунтах з ризосферою, ніж у ґрунтах без ризосфери. Загалом, щоб зрозуміти проблеми з подальшою монокультурою чорного перцю, слід більше уваги приділяти взаємодії між поживними речовинами в ґрунті, ексудатами коренів та мікробною спільнотою, особливо функцією ексудатів коренів у ґрунті ризосфери.

методи

Точки відбору проб

Дослідження було проведено в Науково-дослідному інституті спецій та напоїв (18 ° 72 ′ пн.ш. - 18 ° 76 ′ пн.ш., 110 ° 19 ′ сх.д. - 110 ° 22 ′ сх.д.), місто Ваннінг, провінція Хайнань, КНР. Для цієї місцевості характерний тропічний мусонний клімат із середньою температурою 24,6 ° C, середньорічною кількістю опадів 2150 мм і середньорічною відносною вологістю повітря 85%.

Експериментальні зразки грунту були відібрані 15 липня 2015 року у чотирьох різних чорних спецій (Piper nigrum L. cv. Reyin №1) послідовних монокультурних полів (12, 18, 28 та 38 років) з однаковим агрономічним режимом управління та підживлення. рослини чорного перцю були випадковим чином відібрані для кожного поля чорного перцю, а зразки ґрунту були випадково відібрані у кожної з трьох рослин як одна проба ґрунту. Обережно викопуйте грудочки з корінням чорного перцю для кожної рослини. Грунт, що знаходився на відстані більше 1 см від коренів, був зібраний і вважався вільним від ризосфери. Потім обережно видаліть ґрунт на 5 мм від коренів за допомогою щітки та пінцета. Грунт, прилеглий до кореневих сегментів, на відстані 1-5 мм від поверхні кореня, струшували і визначали як грунт з ризосферою. Всі зразки грунту поміщали в стерильні поліетиленові пакети, поміщали в крижану коробку і передавали в лабораторію. Після проходження через сито 2 мм кожну пробу розділяли на дві підпроби: одну порцію сушили на повітрі для аналізу характеристик ґрунту, а решту зберігали при -80 ° C для вилучення ДНК.

Вилучення ДНК та секвенування Illumina MiSeq

Загальну ДНК було вилучено з 24 зразків ґрунту за допомогою набору для ізоляції ДНК MoBio PowerSoil® (Mo Bio Laboratories Inc., Карлсбад, Каліфорнія, США) відповідно до інструкцій виробника. Концентрацію і чистоту геномної ДНК вимірювали за допомогою спектрофотометра NanoDrop ND-2000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).

Праймери 515F (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) та 806R (GGACTACVSGGGTATCTAAT) використовували для ампліфікації гіпер-варіабельних областей V4 гена бактеріальної 16S рРНК. Праймери гриба ITS1F (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA) 36 та ITS2 (GCTGCGTTCTTCATCGATGC) 37 були обрані для націлювання на область ITS1. Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили згідно з нашою попередньою публікацією 23, 38. Нарешті, парне секвенування проводили за допомогою секвенсора Illumina MiSeq в Personal Biotechnology Co., Ltd (Шанхай, Китай).

Аналіз послідовності на основі OTU

Аналіз послідовності на основі OTU проводили, використовуючи наші попередні методи 38. Коротко, після видалення адаптерів та послідовностей праймерів, сирі послідовності збирали для кожного зразка відповідно до унікального штрих-коду за допомогою QIIME 39. Розділені послідовності для кожного зразка об'єднали за допомогою FLASH V1.2.740, а низькоякісні послідовності відкинули на QIIME. Послідовності, залишені для кожного зразка, обробляли згідно встановленого конвеєра UPARSE 41. Коротко кажучи, послідовності з показником якості менше 0,5 або менше 200 bp були видалені. Після видалення синглтонів, решта значень були присвоєні OTU з порогом 97% ідентичності. Потім проводили процеси видалення химера. Нарешті, бактеріальні репрезентативні послідовності шукали в базах даних RDP 42, 43, а грибко-репрезентативні OTU класифікували за допомогою бази даних UNITE 44 .

Визначення фізико-хімічних властивостей ґрунту

Фізико-хімічні властивості ґрунту визначали так само, як і в нашій попередній публікації 23. Коротко, рН ґрунту вимірювали за допомогою скляного електродного вимірювача у суспензії ґрунт-вода (1: 5 мас./Об.). ОМ та АН (гідролізується N) визначали зовнішнім нагріванням дихромату калію. AP визначали методом молібденового синього. АК визначали полум'яною фотометрією.

Статистичний аналіз

Покриття, багатство (індекс Чаоля) та різноманітність (індекс Шеннона) використовувались для оцінки α-різноманітності кожної вибірки за допомогою Mothur (версія 1.36.0). Кореляційні зв'язки між рясними ворсинами ґрунту та характеристиками ґрунту визначали RDA з використанням веганського пакету R (версія 3.2.3). Односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA) з тестами HSD Tukey з декількома діапазонами був проведений для багаторазових порівнянь з використанням SPSS V20.0 (SPSS Inc., США), а кореляції рангу Спирмена розраховані за допомогою SPSS V20.0 (SPSS Inc., США ). ).

Детальніше

Як цитувати цю статтю: Li, Z. та ін. Різні реакції ґрунтових мікробних спільнот ризосфери та нерізосфери на послідовні монокультури Piper nigrum L. Sci. Респ. 6, 35825; doi: 10, 1038/srep35825 (2016).

Додаткова інформація

Файли PDF

Додаткова інформація

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов надання послуг та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте щось образливим або не відповідаєте нашим умовам чи інструкціям, позначте це як невідповідне.