Нова техніка революціонізує генну інженерію. Але чи є молекулярні ножиці CRISPR/Cas9 настільки вигідними, як вони обіцяють?
Техніка редагування генів CRISPR/Cas9 працює як селективні ножиці, які вирізають та модифікують будь-яку послідовність геному з великою точністю та ефективністю. Але чи завжди вони надійні? [iStock/vchal]
Генна інженерія переживає поновлення. Через десять років після проекту «Геном людини», який не дав усіх очікуваних результатів, з’явилася техніка, можливості якої здаються безмежними. CRISPR/Cas9, молекулярні ножиці, які модифікують ДНК у вибраних точках з безпрецедентною точністю, викликають нові надії. Стратегія вже зробила революцію у всіх сферах генної інженерії, і вважається незаперечним, що її першовідкривачі будуть гідні Нобелівської премії. Однак метод не позбавлений проблем. Небажані наслідки, які це може спричинити, технічні обмеження та етичні заперечення є серйозними перешкодами для редагування генів.
Як працює CRISPR/Cas9?
Техніка редагування генів CRISPR/Cas9 заснована на складній імунній системі бактерій, яка захищає їх від вірусів. Це набутий, або адаптивний, імунітет, який «запам’ятовує» послідовності ДНК патогенів від попередніх атак і ріже їх ДНК у разі нової інфекції.
Саме ця комбінація розпізнавання та різання використовує техніку CRISPR/Cas9. У найпростішому варіанті в клітину вводять РНК, що кодує білок, званий Cas9, і послідовність розпізнавання. Клітина використовує РНК для синтезу білка, який запускається спільно з доданою РНК-розпізнаванням: Cas9 розрізає дволанцюгову ДНК саме там, де асоційований фрагмент РНК про це говорить. Оскільки можна штучно синтезувати будь-яку послідовність РНК, така комбінація дозволяє вирізати будь-який геном де завгодно, принаймні теоретично.
Так звані послідовності CRISPR, присутні в генетичному матеріалі бактерій, були відомі з 1980-х рр. Мікробіолог Франсіско Дж. М. Мохіка з Університету Аліканте вніс основну роль у їх відкриття та названня. Абревіатура розшифровується як "регулярно розташовані кластеризовані короткі паліндромні повтори", тобто повторювані короткі паліндромні послідовності, відокремлені іншим генетичним матеріалом і які часто з'являються в геномі в певних місцях. Виявилося, що генетичний матеріал між повторюваними послідовностями часто надходив від вірусів, що дозволило нам зробити висновок, що CRISPR відповідає системі, яка дозволяє бактеріям захищатися від них.
Пізніше було помічено, що всі бактерії з цією системою мали поблизу CRISPR асоційовані гени, які називали cas. Вони становлять важливий елемент противірусного захисту. Система CRISPR у бактерії "збирає" вірусну ДНК та інтегрує її частини серед повторюваних послідовностей бактеріального геному. В результаті клітина виробляє РНК, комплементарну вірусної ДНК, і збирає її з білками Cas. Якщо вірус намагається повторно заразити клітину цією ДНК, РНК «розпізнає» геном вірусу, а потім білки Cas розрізають його, щоб він знову не завдав шкоди.
Походження методики редагування генів базується на відкритті, що білки Cas розрізають будь-яку ДНК до тих пір, поки вони забезпечені відповідною розпізнавальною РНК, і це те, що робить CRISPR/Cas9. Після різання покладаються на природні механізми відновлення клітини, які запускаються спонтанно.
Якщо в той час лише дві частини геному розділені, втручається клітинний механізм відновлення, який знов з’єднує їх, хоча він часто є неточним і утворює так звані індели, дрібні фрагменти ДНК, які вставляються або усуваються в момент різання, і що може вимкнути задіяні гени. Однак, коли ДНК вільно плаває в клітині з двома вільними кінцями, втручається інша більш точна система, яка називається гомологічним рекомбінаційним репарацією (HDR), яка знову їх з'єднує і призводить до специфічних змін у геномі.
Які етичні проблеми?
Експерти вже давно обговорюють основні етичні проблеми, пов'язані з генетичною модифікацією людини. Але до цих пір дебати були суто гіпотетичними, оскільки процедури були надто грубими та неточними, щоб їх можна було серйозно перевести на людські випробування. Але редагування генів дозволяє, в принципі, вносити зміни в геном з високою точністю. Фактично, ще в 2015 році кілька китайських робочих груп повідомили, що, використовуючи метод CRISPR/Cas9, вони намагалися усунути певні спадкові хвороби з людських ембріонів. На сьогоднішній день відновлення генів, що викликають захворювання, є найбільш очевидним застосуванням у людей, оскільки ніхто не може заперечити проти його терапевтичних цілей.
Або насправді так? Критики побоюються, що такі процедури ще більше відкладуть визначення "генетичного дефекту" до тих пір, поки всі, крім найнеобхідніших генетичних варіантів, не будуть визнані дефектними і тому потребують ремонту. Дизайнерська дитина, зроблена на міру, тема багатьох більш-менш корисних міркувань щодо етики модифікацій зародкової лінії, таким чином, з'являється під приводом зцілення.
Однак найактуальнішою проблемою є не можливі наслідки немовлят-дизайнерів, а скоріше наслідки, які матимуть такі експерименти з огляду на надзвичайно неповне знання про фактичні генетичні ефекти. Дослідження для створення "нестандартної" дитини можуть зайняти десятиліття, проте не ясно, чи таке очікування стримуватиме всіх. Можливо, такі експерименти просто заборонені, оскільки в 2015 році експерименти, що збільшують зараженість певними вірусами.
Навпаки, ліквідація спадкових захворювань вже на порядку денному. У деяких випадках виправлення одного гена, або, можливо, окремого алеля, найімовірніше стане можливим найближчим часом. Більшість експертів вважають цей варіант етично виправданим. Однак навіть у цьому випадку існує ризик того, що втручання може мати непередбачувані довгострокові наслідки, якщо, наприклад, виправлений ген передається нащадкам і має на них наслідки, яких ніхто не передбачав. Останнім часом дивовижне повідомлення китайського дослідника про те, що він народив двійню з геномом, відредагованим для захисту їх від ВІЛ, викликало величезні суперечки.
Сьогодні CRISPR/Cas9 та суміжні методи вже революціонізують усі сфери, в яких генетична модифікація може представляти інтерес. Генетичне редагування простіше і точніше, ніж будь-яка інша техніка, розроблена до цього часу. Але перш за все, повинно бути зрозуміло, що мається на увазі під "генетично модифікованим організмом": чи це ген, модифікований CRISPR/Cas9 в одному місці? Або він щойно додав новий варіант до свого природного генофонду? Це свиня без своїх ендогенних ретровірусів, як будь-яка інша свиня?
Цікаво буде побачити реакцію споживачів, коли такі організми займають полиці супермаркетів як продукти на порозі між "природним" та "штучним". Тоді, найпізніше, справжнє технічне питання визначення генної інженерії стане емоційним. Багато людей не хочуть бачити на своїй тарілці нічого, що є «генетично модифікованим»; Але це вимагатиме розпізнавання модифікованих організмів, навіть якщо їх змінені гени не відрізняються від природних варіантів, а тому можуть також гібридизуватися з незміненими організмами. Така прозорість навряд чи була б можливою за існуючої системи, особливо щодо тваринництва.
Етичні міркування навколо CRISPR/Cas9 також стосуються/балансу між передбачуваними перевагами та ризиками техніки, такими як можливість модифікації небажаних місць у геномі. Екосистемам також може загрожувати випуск комарів або генетично модифікованих сільськогосподарських продуктів у дику природу. Також незрозуміло, яким є ризик переходу модифікованого генетичного матеріалу до інших видів. З іншого боку, важко передбачити наслідки відмови від техніки, коли вона намагається вилікувати захворювання. У цьому випадку протидія потужному CRISPR/Cas9, незважаючи на його основні недоліки, є не менш суперечливою.
Які обмеження мають CRISPR/Cas9?
За своїм біологічним походженням CRISPR/Cas9 є інструментом руйнування: розрив подвійного ланцюга являє собою досить різке втручання геному, і його часто неможливо відновити, не залишивши постійних пошкоджень. Ця властивість може бути корисною при спробі вимкнути ген за допомогою так званих indels: пар основ, які видаляються або додаються і роблять ділянку геному нечитабельною. На жаль, індели також іноді виробляються, коли додаткова ДНК включається через систему відновлення HDR.
Якщо потрібна високоточна генетична модифікація, як при генній терапії, дволанцюжкові розриви в оригінальній системі CRISPR є, отже, фундаментальною проблемою, якої хочеться уникнути. Наприклад, новіші варіанти CRISPR/Cas9 обрізають лише одну нитку, значно зменшуючи показники непотрібних місць у геномі та значно покращуючи точність техніки.
Тим не менше, небажаних змін у системі CRISPR/Cas9, тих, що відбуваються в місцях геному, крім передбаченого, ніколи не вдається повністю уникнути. Вони можуть мати місце, оскільки фермент різання Cas9 працює, навіть якщо розпізнавальна РНК відрізняється від послідовності ДНК до п’яти місць. Такі помилки надзвичайно важко виявити пізніше. Або протилежний ефект може статися в генах, які нібито були інактивовані: навіть якщо бажана мутація включена в потрібне місце в геномі, ген продовжує правильно "зчитуватися".
Сучасна техніка CRISPR/Cas9 також має інші проблеми. Незважаючи на те, що він може точно вирізати з геному визначене місце, він вимагає існування певної генної послідовності, яка не може бути обрана за бажанням. Це має місце у більшості геномів, хоча не у всіх (і, звичайно, ніколи над тим, над яким працює). Крім того, механізм CRISPR/Cas є дуже громіздким, що ускладнює введення в ранні ембріональні клітини ссавців: ген cas і розпізнавальна РНК просто занадто великі для загальновживаних генетичних "транспортерів", вірусів, які вводять генетичний матеріал у клітину інтересу. РНК потрібно вводити безпосередньо, обмежуючи ефективність.
Насправді одним з найважливіших параметрів методики редагування генів є її ефективність; Іншими словами, в якій пропорції цільовий геном модифікується бажаним способом. Жодна із використовуваних сьогодні генетичних ножиць не гарантує, що вони виконають свою місію; насправді ймовірність того, що вони зроблять це, є відносно низькою, навіть у деяких найбільш перспективних додатках. CRISPR/Cas9 насправді не бере участі у редагуванні цікавить гена. Це відбувається більш-менш випадково. Наприклад, в індукованих плюрипотентних стовбурових клітинах людини ефективність CRISPR/Cas9 становить від 2 до 5 відсотків. В інших системах, таких як ембріони даніо, ймовірність успішної мутації іноді перевищує 70 відсотків, хоча генна терапія спадкових захворювань риб є не дуже великим ринком.
Якими будуть подальші програми CRISPR/Cas9?
У дослідженні біотехнологій CRISPR/Cas9 досяг чудових позицій як інструмент генної інженерії. Він навіть пішов далі з новими версіями, які дозволяють конкретно регулювати активність генів у лабораторії. Для цього використовується інактивований білок Cas9, який лише міцно прилипає до певних шматочків ДНК. Якщо такий білок зв'язується з промоторним доменом, активність відповідного гена збільшується. Якщо замість цього ви блокуєте послідовність самого гена, відповідний сектор геному перестає перетворюватися в РНК. За допомогою різних білків, пов'язаних з неактивними системами Cas9, тепер також можна досліджувати епігенетичні ефекти, наприклад, шляхом флуоресцентного маркування просторового положення певних послідовностей. Завдяки асоційованим ферментам, які розщеплюють або приєднують метильні або ацильні групи, такі системи CRISPR/Cas9 можуть також змінювати епігенетику клітин.
Але перш за все, CRISPR/Cas9 в даний час використовується для дуже ефективного створення генетично модифікованих організмів, тих, у яких певний ген був модифікований, вставлений або інактивований за допомогою мутації. Такі процедури набагато старші за CRISPR. Наприклад, у 2007 році винахідникам так званого генетичного нокауту була присуджена Нобелівська премія з фізіології та медицини. Однак техніка CRISPR/Cas9 є швидшою, дешевшою та універсальнішою, ніж попередні методи. Одну з головних проблем CRISPR також можна вирішити в лабораторії: необхідний розмір РНК. В даний час, наприклад, існує кілька штамів мишей, які несуть білок Cas9 у власному геномі; як тільки певний молекулярний сигнал, такий як відповідна розпізнавальна РНК, досягає клітини, молекула чекає зміни геному.
Також проводяться перші модифіковані організми, мета яких, окрім фундаментальних досліджень, має практичне застосування. Таким чином, якщо плани вчених будуть успішними, у майбутньому будуть вироблятися кращі моделі тварин для різних захворювань людини, а також будуть розроблені сільськогосподарські культури та тварини з певними характеристиками, такі як комарі Anopheles, стійкі до малярії. Цікавим прикладом є усунення з геному свині потенційно небезпечних ретровірусів, що є важливою вимогою до плану генерування людських органів у тварин.
Крім того, CRISPR/Cas9 вдосконалив техніку, яка називається генним приводом, механізм, за допомогою якого певні штучні ознаки швидко поширюються в популяціях диких тварин. Це цікаво для боротьби з комарами, які передають серйозні захворювання в деяких регіонах. Медичні дослідження також зосередили увагу на CRISPR/Cas9 як інструменті боротьби з патогенними вірусами та бактеріями, щоб зробити точні скорочення в ДНК цих мікроорганізмів та запобігти їх процвітанню. Однак досі не зовсім зрозуміло, як транспортувати необхідну РНК до потрібного місця при справжньому захворюванні.
Які альтернативи існують техніці CRISPR/Cas9?
Одне можна сказати точно: незважаючи на рішення у патентному суперечці між Еммануель Шарпентьє та Дженніфер Дудна, з одного боку, та Фен Чжаном, з іншого, битва за переваги методу CRISPR/Cas9 ще тільки розпочалася. Завдяки величезному потенціалу техніки роялті зараховуються у мільярди. Але якщо поглянути на це в перспективі, можливо, ні. Хоча Каліфорнійський університет все ще може отримати хоча б шматок пирога, різні дослідницькі групи вивчають інші варіанти цієї техніки.
Оскільки, як ми вже бачили, CRISPR/Cas9 має недоліки та обмеження. Найголовнішим є те, що генетичні ножиці насправді придатні лише для різання ДНК. Якщо ви хочете включити новий генетичний матеріал, ви повинні довіряти клітині. У багатьох випадках методика є недостатньо ефективною для одночасної модифікації декількох генів, як бажано. Крім того, CRISPR/Cas9 не вирізає на всіх сайтах геному.
З цієї причини від методів, що передували CRISPR/Cas9, не вдалося повністю відмовитись: і TALEN, і нуклеази цинкових пальців, два старіші типи генетичних ножиць, все ще використовуються в генній інженерії. Ці процедури набагато складніші. Однак, якщо, крім недоліків CRISPR/Cas9, невизначеність щодо ліцензійних зборів зберігатиметься ще протягом багатьох років, експерти можуть відійти від CRISPR/Cas9, принаймні, коли мова йде про дослідження з можливими комерційними додатками.
Дослідження інших варіантів також тривають. Навесні 2016 року китайська дослідницька група опублікувала роботу, в якій вказується, що білок під назвою NgAgo робив те саме, що і CRISPR/Cas9, навіть краще. Але результати виявилися передчасними. Як це сталося з хвилюванням, що збудив білок під назвою лямбда-червоний, який повинен мати реальну здатність редагувати гени і який досліджував Чжан, піонер CRISPR, протягом 14 років без особливого успіху.