реферат

Головний

Порівняно з генотиповою HLA-ідентичною трансплантацією кісткового мозку (BMT), не пов’язане донорське трансплантація (URD) ​​пов’язане з вищим рівнем смертності. Тяжка гостра хвороба трансплантат проти господаря (aGVHD) та недостатність трансплантата є основними причинами смертності, пов’язаної з трансплантацією (TRM), і можуть бути пов’язані зі ступенем несумісності HLA.

Попередні стандарти типізації HLA включали серологічні методи молекул HLA-A та -B та типізацію HLA-DRB1 на основі ДНК. Ідентичність донора-реципієнта HLA-DRB1 знижує ризик aGVHD та покращує виживання після URD-BMT.5678 Однак ризик aGVHD, відмови трансплантата та смерті залишається вищим у пацієнтів, яким трансплантували HLA-A, -B та -DRB1. серед пересаджених HLA-ідентичних братів і сестер.1 Недавні дослідження показують, що ці ускладнення можуть бути наслідком відмінностей між HLA-A та -B між пацієнтом та донором.89101112 Насправді на молекулярному рівні описано більше 300 алелей. 85 серологічно визначених антигенів класу I.13. Крім того, серологічно "парні" пари HLA-A та -B насправді часто не відповідають HLA-C. 141516 Однак клінічні наслідки таких невідповідностей видаються неясними. У дослідженні Петерсдорфа та співавт. 10 невідповідностей класу I HLA корелювали більше з відмовою трансплантата, ніж з гострою РТПХ, і впливали на виживання лише у випадках із множинними невідповідностями. На противагу цьому, у дослідженні Сасазукі та співавт. 9 навіть одна невідповідність HLA-A або B впливала на виживання, збільшуючи важку гостру РТПХ. У цьому дослідженні невідповідність C-локусу було пов'язано зі зниженням частоти рецидивів, і вплив невідповідності класу I на клінічний результат виявився навіть важливішим, ніж невідповідність класу II.

На додаток до молекулярної типізації, були розроблені клітинні аналізи для прогнозування впливу відмінностей HLA класу I на ймовірність aGVHD. Вони полягають у визначенні частоти цитотоксичних донорських попередників Т-клітин (CTLp) зі специфічністю до реципієнта (напрямок GVHD) .17 Низькі частоти CTLp сильно корелюють з HLA-A та -B ідентичними.811

Оскільки використання URD-BMT збільшувалось із збільшенням обсягу реєстрів донорів, для покращення клінічної практики терміново потрібно більше даних з цієї теми, а для кожної клінічної групи з BMT необхідна ретроспективна оцінка попереднього досвіду. Метою цього дослідження було визначити вплив відмінностей класу HLA I та II на результат пацієнта після URD-BMT. Ми переробили HLA класів I та II, використовуючи методи ДНК із високою роздільною здатністю, у 69 парах реципієнтів-донорів, трансплантованих у вересні 1988 року - червні 1998 року в нашому закладі. Частоти CTLp також визначали у 33 з цих пар.

Матеріали і методи

Процедура BMT

Дослідження включало 69 послідовних процедур URD-BMT, проведених у період з вересня 1988 р. По червень 1998 р. В університетській лікарні Генрі-Мондора (табл. 1). Троє пацієнтів пересаджували двічі. Донорів ідентифікували через європейські та NMDP реєстри. Основні характеристики пацієнтів, які передували ІМТ, узагальнені в таблиці 1. Пацієнти були розділені на дві групи за статусом захворювання при БМТ: 32 реципієнти з ХМЛ у першій хронічній фазі або гострим лейкозом у першій чи другій ремісії становили стандартну групу ризику . та 37 пацієнтів із більш розвиненою ІМТ потрапляли до групи високого ризику.

Стіл в натуральну величину

Перші 66 процедур BMT були проведені після мієлоаблативного кондиціонування, включаючи загальне опромінення тіла (n = 59) або режим на основі бусульфану (n = 7). Три другі трансплантати з використанням іншого донора були виконані після прокарбазин-циклофосфаміду та антитимоцитарного глобуліну. Профілактика РТЗ комбінованого циклоспорину та метотрексату відповідно до протоколу Сіетла.18 Усі пацієнти отримували немодифікований кістковий мозок. Гострий РТПХ класифікували за визначенням Глюксберга та співавт. 19 та лікували стандартними дозами стероїдів у разі відмови високих доз стероїдів або АТГ.

Типізація HLA та сполучення пацієнта-донора

Введення HLA перед BMT:

Донори були відібрані на основі типізації HLA-A та -B з використанням методики мікролімфоцитотоксичності20, яка визначила відповідні особливості, визнані Всесвітньою організацією охорони здоров’я (ВООЗ) на момент трансплантації. Типізація HLA класу II виконувалась методами, доступними на момент трансплантації. Таким чином, фенотипи HLA-DR та -DQ вивчали при низькій роздільній здатності у 14 парах із використанням серології (n = 3) або RFLP (поліморфізм довжини фрагмента рестрикції) (n = 11), тоді як в інших 55 парах, HLA-DRB1, Типізацію -DQB1 та -DPB1 проводили з високою роздільною здатністю за допомогою ПЛР-зворотного крапкового крапки (Innogenetics, Брюссель, Бельгія) плюс PCR-RFLP2122 для HLA-DRB1 та -DQB1.

Ретроспективне введення HLA:

Типізацію HLA класу I проводили ретроспективно з використанням PCR-SSP (праймер із специфічною послідовністю) (Dynal, Осло, Норвегія).

Серологічні «заготовки» HLA-A та HLA-B повторно набирали за допомогою ДНК-типізації з низькою роздільною здатністю. Всі серологічно експресовані антигени HLA-A визначали на алельному рівні. Серологічно експресовані антигени HLA-B визначали з високою роздільною здатністю відповідно до наявності комерційних наборів (фенотип HLA-B був повністю визначений у високій роздільній здатності у 39 з 69 пар донорів-реципієнтів). Локус HLA-C вивчали методом, що визначає алелі Cw1-18.

HLA-DRB1, -DQB1 та -DPB1 були повторно набрані в 14 парах донорів-реципієнтів, раніше записаних із низькою роздільною здатністю.

Розрахунок частот CTL-p

Аналізи CTLp проводили, як описано у Kaminski et al. 17 Коротко, аналізи проводили у напрямку "GVHD", використовуючи донорські клітини як клітини-відповіді, а клітини-реципієнти як стимулюючі клітини. Лунки вважали позитивними, якщо їх вивільнення 51 Cr перевищувало середнє значення плюс 3 стандартних відхилення (sd) негативного контролю (стимулюючі клітини без клітин, що реагують на клітини). Частоти CTLp нижче 1/300000 вважалися негативними.8

Статистичні методи

Дані були зібрані та оновлені станом на 15 листопада 1998 р., Забезпечуючи мінімальне спостереження 7 місяців, максимум 122 місяці та медіану виживання 29 місяців (діапазон 7 - 122 місяці). Оцінені ймовірності aGVHD, TRM та виживання були розраховані та побудовані за методом Каплана-Мейєра та порівняні за допомогою тесту log-rank. Пацієнти, яким була проведена друга трансплантація, були піддані цензурі для першої трансплантації в день другої ІМТ.

результат

Частоти набору тексту HLA та pCTL

На момент трансплантації було відомо, що шість пар донорів-реципієнтів не відповідають або антигену HLA-A, або -B (UPN 671, 588, 536, 620, 629, 643); дві пари не відповідали HLA-DQB1 (UPN 495, 547), а одна пара не відповідала HLA-A та -DQB (UPN 502) (таблиця 2).

Стіл в натуральну величину

Ретроспективне типізування ДНК підтвердило всі серологічно виявлені розбіжності. Подальші розбіжності були виявлені у семи з дев'яти відомих непов'язаних пар донор-реципієнт (Таблиця 2). Серед 60 пар інших реципієнтів-донорів розбіжності HLA, які не були виявлені на момент трансплантації, були виявлені у 27/60 (45%), тоді як 33/60 (55%) пар були підтверджені ідентичними для HLA-A, -B Алелі -C, -DRB1 та -DQB1. Таким чином, після ретроспективного набору тексту 36/69 (52%) пар донор-реципієнт не збігалися. З цих пар 27 не узгоджувались лише з антигенами HLA класу I, п'ять пар не узгоджувались лише з антигенами HLA класу II, а чотири не відповідали антигенам HLA класу I та класу II.

HLA клас I

Серологічно порожні фенотипи завжди підтверджувались типізацією ДНК із низькою роздільною здатністю, яка також показала, що одна особа була неправильно ідентифікована серологічним типізуванням (HLA-B57 (17) замість HLA-B58 (17) (UPN 502)). Серед 62 пар, на яких серологічно відповіли HLA-A та -B під час трансплантації, у 13 після ретроспективного введення було виявлено невідповідність HLA-A та/або -B (таблиці 2 та 3). Антигени HLA-B визначали шляхом типізації з високою роздільною здатністю у 17/33 парних донорів та реципієнтів та 22/36 невідповідних пар.

Стіл в натуральну величину

Серед 69 пар було 23 невідповідності HLA-C (таблиця 3). Десять мали лише одне невідповідність антигену HLA-C, тоді як 12 також мали невідповідність HLA-A та/або -B, а один також мав одне невідповідність класу HLA класу II (таблиці 2 та 4). Усі молекули HLA-B були записані у високій роздільній здатності у 10 парах із невідповідністю HLA-C. Таким чином, після ретроспективного типування ДНК у 31/69 (45%) пар було принаймні одне невідповідність HLA класу I.

Стіл в натуральну величину

HLA клас II

Серед 14 пар реципієнтів-донорів, які були фенотиповані з низькою роздільною здатністю на момент трансплантації, виявлено розбіжності в ретроспективному типізації у шести ймовірно пар ідентичних донорів - реципієнтів HLA класу II; три з них не відповідали HLA-DQB1 (UPN 392, 441, 380), один не відповідав HLA-DRB1 і -DQB1 (UPN 373), а два не відповідали класу HLA I та II класу (UPN 426, 306) (таблиця 2 )). Отже, пара донорів-реципієнтів 9/69 не відповідала HLA класу II.

Типізація HLA-DPB1 показала, що лише дев'ять пар пацієнт-донор були спарені у зв'язку з цим. Загалом лише п’ять пар HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 та -DPB1 були ідентичними.

Гаплотипи предків

Щоб визначити, чи можна передбачити частоту невідповідності, виявленої типізацією ДНК із високою роздільною здатністю, на основі збережених гаплотипів, ми класифікували фенотипи HLA пар донорів-реципієнтів, виявлених під час трансплантації, на основі ймовірної присутності одного або двох 25 предків, визначених Christiansen et al. регулювання). Дві пари можуть мати дві АГ, 29 одну АГ і 30 не АГ. Серед 122 проаналізованих гаплотипів невідповідність класу HLA класу I була більш поширеною після ДНК з високою роздільною здатністю в гаплотипах, які вважалися ненародженими, ніж у АГ (21/89 проти 2/33) (P = 0,017 точний тест Фішера).

Частоти CTLp визначали для 33 пар. Після типізації ДНК 14 пар класу HLA класу I були невідповідні в напрямку GVHD і 19 пар були спарені (таблиця 5). Серед 14 пар, які не збігалися, висока частота CTLp була виявлена ​​у дев'яти пар, а низька - у п'яти. З цих останніх п’яти пар дві невідповідності HLA-A (UPN 671, 547), одна невідповідність HLA-B (UPN 642) і дві невідповідності HLA-C (UPN 680, 668). Низькі частоти CTLp були виявлені у 19 пар у напрямку GVHD.

Стіл в натуральну величину

зловити

Шість пацієнтів померли до 30 дня після трансплантації, що вказує на те, що можна було оцінити 63 трансплантати. Збій трансплантата стався у п’яти випадках. Чотири з п'яти пар були класом HLA класу I, невідповідним у напрямку HVG (хост проти трансплантата) (UPN 526, 436, 617, 536), а одна була ідентичною. У двох пацієнтів було одне невідповідність антигену HLA-C (UPN 617, 436), одному - невідповідність антигену HLA-B (UPN 526), ​​а одному - невідповідність HLA-B та -C (UPN 536).

AGVHD, TRM та виживання

Дев'ятнадцять із 66 пацієнтів живі (медіана 28 місяців, діапазон 7–122 місяців після ІМТ), включаючи пацієнтів з аутологічним відновленням (UPN 617) та пацієнтів з рецидивом лімфоми (UPN 600). Загальний коефіцієнт виживання для всієї когорти становить 28 ± 6%, а значення корелюють з гематологічним статусом (55% проти 9%) (P

здатність

Оцінки виживання Каплана-Мейєра у пацієнтів із "стандартним статусом ризику" (суцільна лінія) порівняно з пацієнтами з "статусом високого ризику" (пунктирна лінія). Імовірність виживання становила 55% для пацієнтів зі стандартним ризиком та 9% для пацієнтів із високим ризиком (P

Оцінки виживання Каплана-Мейєра у пацієнтів, яким було проведено трансплантацію HLA класів I та II (суцільна лінія), порівняно з тими, хто отримував трансплантації HLA класів I та/або II (пунктирна лінія). Ймовірність виживання становила 40% у пацієнтів, які відповідали на це захворювання, та 20% у пацієнтів, які не відповіли (P

Ймовірність III-IV ступеня aGVHD у HLA-сумісних (суцільна лінія) та HLA-невідповідних трансплантаціях (пунктирна лінія). Серед пацієнтів, яких можна оцінити на РТПХ, у 2/30 співпадаючих пацієнтів та 16/33 невідповідних пацієнтів розвинувся тяжкий РПЗЗ (P

Оцінки виживання Каплана-Мейєра у пацієнтів, які отримували відповідні трансплантації HLA класів I та II (суцільна лінія), порівняно з тими, хто переніс невідповідну трансплантацію класу I HLA (пунктирна лінія). Імовірність виживання становила 42% для трансплантатів, що відповідають класам HLA I та II та 18% для трансплантатів, що відповідають невідповідностям класу HLA I та II класу (P

Порівняння оцінок виживання Каплана-Мейєра у чотирьох підгрупах: "стан стандартного ризику" та відповідні трансплантації; "Стандартний стан ризику" та невідповідні трансплантації; «Стан високого ризику» та відповідні трансплантації; «Високий ризик» та невідповідні трансплантації. Імовірність виживання становила 66%, 31%, 9% та 8%.

Повнорозмірне зображення

обговорення

Наше дослідження чітко підтверджує, що виживання після URD-BMT може бути покращено шляхом відповідності донора та реципієнта для HLA-A, -B, -C на високому рівні роздільної здатності, припускаючи, що несумісність HLA виявлялася лише шляхом типізації з високою роздільною здатністю (тобто відсутня звичайні методи) є клінічно значущими. Хоча це було відомо для спарювання HLA класу II протягом декількох років, це було визначено лише для HLA класу I двома недавніми дослідженнями.910 Наше дослідження показує високу частоту невідповідності класу HLA класу між HLA-A та -B серологічно ідентичним донором -пари одержувачів. Дійсно, аллельні невідповідності HLA-A та/або -B були виявлені у 13/62 (21%) серологічно парних пар та у 6/7 (86%) пар, які, як відомо, не відповідали на момент трансплантації. Крім того, це дослідження підкреслює високу частоту невідповідності HLA-C (23/69, 33%), яка мала місце у 11/23 випадків без невідповідності HLA-A та/або -B.

Цікаво, що наш аналіз свідчить про те, що АГ рідше асоціюються з аллельними диспропорціями класу HLA, що узгоджується з дослідженням Прасада та співавт. 12 Однак слід зазначити, що сегрегація АГ базується на розрахунку ймовірності і не може бути визначена. донорські сімейні дослідження.

Нещодавно в багатьох одиницях трансплантації були введені аналізи CTLp для виявлення відсутніх невідповідностей класу HLA класу I або для прогнозування aGVHD.8 У нашому центрі результати CTLp використовувались для відбору донорів до трансплантації та донорів з найвищими показниками CTLp. У цьому дослідженні, порівнюючи типізацію CTLp та ДНК, високі аналізи CTLp завжди асоціювались із невідповідністю класу HLA класу I. Однак негативні аналізи CTLp спостерігались у п’яти парах, незважаючи на невідповідність GVHD (включаючи три випадки невідповідності HLA-A або - B), що узгоджується з дослідженням Скотта та ін. 11 CTLp може бути корисним для виявлення дозвільних невідповідностей HLA класу I. \ T Однак поява важкого AVVHD у двох із чотирьох пацієнтів із невідповідністю лише класу HLA I класу та негативними тестами CTLp не дозволяє підтвердити цю можливість.

Нещодавно два дослідження показали кореляцію між відповідністю класу HLA класу та клінічним результатом.910 Сасазукі та співавт.9 виявили кореляцію між невідповідністю HLA-A, -B та -C та високою частотою серйозних AVVHD, тоді як невідповідність класу I була пов'язана з відторгнення трансплантата в дослідженні. Petersdorf та співавт., 10, особливо для локусу HLA-C.24. З іншого боку, Сасадзукі та ін. виявили, що поєднання HLA-C корелює з ризиком рецидиву лейкемії 21, що може бути пояснено пригнічення активності NK-клітин у випадках ідентичності HLA-C між донором та Різні результати між двома дослідженнями можна пояснити різницею в етнічному походження та гематологічних захворюваннях (пацієнти з ХМЛ порівняно з національним реєстром). У нашому дослідженні спостерігалась висока смертність, пов’язана з трансплантацією, у пацієнтів з невідповідністю класу HLA через високу частоту тяжких РПЗА. Крім того, у цієї групи пацієнтів спостерігали 4/5 випадків відмови трансплантата. Таким чином, невідповідність HLA-C може бути пов'язана з важким aVVHD, а також з відмовою трансплантата, що підтверджує роль HLA-C як трансплантаційного антигену. Вплив ідентичності HLA-C на рецидив лейкемії неможливо проаналізувати в нашій роботі через низьку кількість пар донорів-реципієнтів.

На закінчення випливає, що геномна типізація алелів класу I та II HLA суттєво сприяє успіху трансплантації від неспоріднених донорів, при цьому медіана виживання в тій самій групі є порівнянною з виживанням при трансплантації генетично ідентичними братами та сестрами. Поганий прогноз пацієнтів, які перенесли трансплантацію, не пов'язану з HLA, свідчить про необхідність нових методів трансплантації.