рівень

  • Резюме
  • Вступ
  • Методи
  • Вивчати дизайн
  • Харчові щоденники
  • Екстракція ДОН сечі
  • LC-MS аналіз вилученого ДОН
  • Аналіз креатиніну
  • Статистичний аналіз
  • Результати
  • Обговорення
  • Глосарій

Резюме

Методи

Вивчати дизайн

Дослідження проводилось протягом 7 днів та брало участь 25 добровольців, 16 жінок та 9 чоловіків, віком від 21 до 59 років. У 1 і 2 дні («нормальна дієта») велись щоденники харчової їжі середньої важкості, а на 3 день з першого ранку отримували порожню пробу сечі. У дні 3–6 (“зменшене втручання пшениці”) добровольців попросили обмежити споживання певного списку продуктів, які можуть містити пшеницю (хліб, тістечка, макарони, каші для сніданку тощо) та замінити продуктами з перелік запропонованих альтернатив (наприклад, рис, картопля). На 5 та 6 день харчові щоденники знову велися, і порожній зразок сечі був отриманий протягом першого ранку дня 7. Інформаційна згода була отримана від усіх добровольців перед дослідженням та етичним схваленням Комітету з етики NHS Research, Bradford, Великобританія. .

Харчові щоденники

Харчові щоденники були повністю закодовані з використанням внутрішнього пакету аналізу дієти на основі Microsoft Access, використовуючи UK Food Composition (Holland et al., 1992). Для оцінки відповідності втручанню частоту споживання певних груп продуктів харчування (хліб, тістечка, каші для сніданку та макарони) під час нормальної дієти (дні 1 та 2) порівнювали з частотою втручання (дні 5 та 6). Крім того, було розраховано питому вагу їжі та визначено споживання їжі на основі пшениці для кожної людини на основі основних джерел пшениці (хліб, крупи для сніданку, булочки, макарони, тістечка та печиво). Інші джерела пшениці містяться в раціоні, наприклад, у соусах та загусниках. Однак його внесок у загальне споживання пшениці було оцінено як відносно незначне значення.

Екстракція ДОН сечі

Загальний ДОН в сечі вимірювали за допомогою модифікації методу Meky et al. (2003) та використання 13 C-DON (Biopure Referenzsubstanzen, Tulln, Австрія) як ІС. ІС являла собою суміш, що містила переважно 13 C 15 -DON (молекулярна маса (M r) 311; 81,4%), але також 13 C 14 -DON (M 310); 16,8%). Придатність цієї сполуки як ІС нещодавно була встановлена ​​в LC-MS/MS аналізі злаків, заражених DON (Haubl et al., 2006).

У нашому аналізі сечі зразки центрифугували (2000 г; 15 хв; 4 ° С) і до 4 мл сечі додавали ІС до кінцевої концентрації 5 нг/мл. РН кожного зразка відрегулювали до 6,8, і 23000 U β-глюкуронідази (Escherichia coli Тип IX-A; Sigma) додали в 1 мл 75 мМ KH 2 PO 4 та інкубували на водяній бані при перемішуванні протягом 18 годин. після перетравлення зразки центрифугували (2000 г; 15 хв; 4 ° С) і супернатант розбавляли до 16 мл PBS (pH 7,2). Розведений матеріал пропускали через колонки DONtest ​​Immuoaffinity Columns (IAC) (Vicam, Watertown, MA, USA) для вилучення DON відповідно до інструкцій виробника. ДОН елюювали з колон 4 мл метанолу і екстракти сушили у вакуумі з використанням Savant Speed ​​Vac і розчиняли в 250 мкл 10% (об/об) етанолу для аналізу. Дві аликвоти зразка сечі з відомими рівнями ДОН також додавали до ІС і аналізували з кожною партією досліджуваних зразків як контроль якості (КК).

LC-MS аналіз вилученого ДОН

DON аналізували за допомогою ВЕРХ (модуль розділення Waters 2795, Мілфорд, Массачусетс, США) з детектуванням MS (потрійний квадрупольний мас-спектрометр Micromass Quattro Micro, Манчестер, Великобританія). Розділення ДОН було досягнуто за допомогою колонки Luna C18 (150 × 4,6 мм, розмір частинок 5 мкм (Phenomonex, Macclesfield, UK). Рухливу фазу розпочинали з 20% метанолу і проводили ізократично протягом 10 хвилин. Одна фаза промивання протягом 6 хвилин ). потім його проводили хв, використовуючи 75% метанолу, після чого 20% метанолу знову вводили з рівновагою системи при цій концентрації протягом ще 11 хв. Швидкість потоку становила 1 мл/хв, а об'єм введення - 25 мкл. Елюенти з колонки ВЕРХ направляли в камеру десольвації МС, а решту відправляли у відходи.

Спектр M/z (a) немеченого стандарту DON (200 нг/мл) та (b) стандарту IS (200 нг/мл).

Повнорозмірне зображення

Хроматограма загального іонного струму зразка сечі, що містить 13,1 нг DON/мл сечі, додана до внутрішнього стандарту 13 C-DON. H + трасування (а), що генерується за допомогою SIR Na + DON моніторингових мас 297,2 (DON) та 319,2 (DON); Вироблений SIR слід (b) з 13 моніторингових мас C-DON 333,2 (13 C 14 -DON Na +) та 334,2 (13 C 15 -DON Na +). Час утримання обох сполук становило 7,4 хв.

Повнорозмірне зображення

Аналіз креатиніну

Концентрацію креатиніну вимірювали у всіх зразках сечі за допомогою клінічного методу Байєра на приладі ADVIA Chemistry Systems 1650 (Департамент клінічної біохімії, Лідс, загальна лікарня, Лідс, Великобританія). Кінцеву концентрацію DON у нг/мл сечі регулювали за допомогою даних про креатинін і виражали як нг DON/мг креатиніну.

Статистичний аналіз

Коли ДОН сечі не можна було виміряти, тобто нижче LOQ, середнє значення між LOQ і нулем використовувалось у всіх аналізах. Концентрації ДОН у сечі перетворювали в природний log перед аналізом. Порівняння спарених даних проводили за допомогою t-критерію Стьюдента, а регресійний аналіз застосовували для дослідження впливу віку, статі, антропометрії та споживання їжі на рівень ДОН у сечі як під час споживання. Нормальний, як під час втручання пшениці (за допомогою STATA версія 7.0). Тільки протягом періоду втручання особи розділили на споживачів та неспоживачів споживання їжі на основі пшениці та рівня ДОН у сечі порівняно між групами за допомогою регресійного аналізу в STATA. Для полегшення представлення дані про ДОН сечі знову трансформували, а геометричні середні значення та 95% довірчий інтервал (ДІ) використовували в таблицях.

Результати

Дані демографічного дослідження наведені в таблиці 1. Жінок було більше (n = 16), ніж чоловіків (n = 9). Жінки були нижчі (с

Для 25 осіб було отримано парні зразки для вимірювання дезоксиніваленолу в сечі. Вилуплені бруски призначені для тих, хто споживає звичну дієту, а суцільні чорні бруски - для тих, хто слідує за 4-денним втручанням із зниження пшениці. Для 16 осіб зразки, відібрані після втручання, були нижче межі виявлення.

Повнорозмірне зображення

Обмежена кількість осіб та відносно рівномірне споживання основних потенційних джерел ДОН у фазі нормального раціону дослідження обмежили поглиблений аналіз впливу конкретних продуктів харчування на рівень ДОН у сечі. Порівняно з нормальним періодом дієти, рівень втручання ДОН у сечі був знижений у 24 з 25 осіб. Була лише одна особа, яка не виконала запропонованого втручання. Під час нормальної фази дієти ця людина споживала цільнозерновий хліб (в середньому 131 г/день) як основне джерело пшениці. Для цієї людини хліб з цільної пшениці залишався основним джерелом пшениці під час втручання, а на 5 і 6 день споживання насправді збільшувалось (в середньому 154 г/день). Ця людина була єдиною людиною, для якої рівень ДОН в сечі збільшився, з 5,2 нг/мг на 3-й день до 12,6 нг/мг на 7-й день. Загалом середня вага їжі на основі пшениці, споживаної під час дієти, була нормальною (326 г; діапазон: 40–665 г та 299 г; діапазон: 0–523 г у дні 1 та 2 відповідно) був значно нижчим (P 13 C-DON, оскільки ІС ще більше покращив надійність цього дослідження.

Фармакокінетика виведення ДОН із сечею людини та його метаболітів не встановлена. Однак, здається, глюкуронід швидко утворюється у свиней і має кінетику кліренсу сироватки, подібну до кінетики вихідної сполуки (Goyarts and Danicke, 2006). Фармакокінетика кліренсу ДОН як у свиней (Goyarts and Danicke, 2006), так і у щурів (Meky et al., 2003) припускає, що для виведення більшості раніше введених ДОН після виведення цього мікотоксину з раціону буде достатньо 4 днів. Зниження рівня сечі після нашого 4-денного втручання відповідає прогнозованому для інших сечових біомаркерів на мікотоксини, де маркер, як правило, відображає вплив протягом попередніх 24-48 год через швидку екскрецію (Groopman et al., 1992) .

Нещодавнє опитування SCOOP (2003) у Європейському Союзі підкреслило забруднення зернових та зернових продуктів DON та запропонувало, що в деяких випадках TDI буде перевищено у Великобританії. Однак існує багато невизначеностей у встановленні впливу людини на ДОН на основі аналізу їжі та оцінок споживання зернових. По-перше, відома неоднорідність забруднення мікотоксинами даного харчового продукту, що ускладнює вибірку репрезентативних харчових продуктів для аналізу. По-друге, вплив залежить не тільки від забруднення, але й від рівня споживання. Це можна визначити на підставі обстежень дієти, але це може не враховувати належним чином екстремальне споживання на індивідуальному рівні або в окремих підгрупах популяції, наприклад, вегетаріанців та немовлят. Розробка сечового біомаркеру ДОН обіцяє більш об'єктивний показник впливу на індивідуальному рівні. Цей підхід був успішно досягнутий з використанням афлатоксинів і призвів до значних успіхів у розумінні впливу та наслідків для здоров'я (Wild and Turner, 2002).

З огляду на очевидну загальну експозицію та потужну токсичність, яку проявляє ДОН у тварин (Пестка та Смолінський, 2005), важливо дослідити потенційні наслідки для здоров’я, які мають поточні рівні впливу на людину. Прогнозується, що немовлята та діти мають більш високий рівень споживання порівняно з дорослими, і, як і при більшості токсичних впливів, дуже молоді можуть бути особливо сприйнятливими. Інші групи ризику можуть включати вегетаріанців, які споживають особливо високий вміст злаків. Наявність біомаркерів впливу вперше робить такі дослідження реалістичними.