Можливості лабораторної діагностики інфекцій, спричинених Clostridium difficile

Анотація:

Clostridium difficile з утворенням токсину є найпоширенішою причиною внутрішньолікарняних кишкових інфекцій. Коліт C. difficile - це інфекційне захворювання різного ступеня тяжкості, воно може протікати як поширене діарейне захворювання, псевдомембранозний коліт, а також як стан, що загрожує життю, що супроводжується паралітичним непрохідністю, що переростає у вторинний сепсис. Захворювання найчастіше виникає у зв’язку з лікуванням антибіотиками широкого спектра дії, які усувають нормальну флору кишечника. Передача C. difficile відбувається спорами фекально-оральним шляхом. Рання діагностика інфекцій C. difficile є важливою через розпочату адекватну терапію, а також протиепідемічні заходи для запобігання подальшому поширенню спор в лікарняному середовищі.

діагностики

Ключові слова: Інфекції Clostridium difficile, псевдомембранозний коліт, лабораторна діагностика, глутаматдегідрогеназа, токсигенний штам

* Усі таблиці, графіки та малюнки, які є частиною статті, можна знайти у вкладеному PDF-файлі в кінці дослідження.

Вступ

Патогенез захворювання

Епідеміологія захворювання

Терапія

Процедури лікування CDI закріплені в словацьких рекомендаціях щодо діагностики та лікування коліту, спричиненого C. difficile (7). Загальними рекомендаціями при лікуванні легких форм ІРЗ є: припинення лікування АТБ, що спричинило інфекцію (якщо це можливо), регідратація, дієта без залишків. Якщо у пацієнта низький рівень альбуміну, потрібна парентеральна заміна. Препарати, що пригнічують перистальтику кишечника (спазмолітики, опіати), протипоказані. Для лікування середньотяжких, важких та рецидивуючих форм ІКД рекомендується медикаментозне лікування антибіотиками: метронідазол, ванкоміцин та новий макроциклічний антибіотик фідаксоміцин. Пробіотики використовуються як інші можливості підтримуючого лікування, а в останній період також і т. Зв фекальна бактеріотерапія. Трансплантація стільця є офіційно рекомендованим методом лікування множинних рецидивів ІХС з високим рівнем успіху, який також долає існуючі схеми антибіотиків (13).

CDI лабораторної діагностики

Сьогодні для мікробіологічної діагностики ІРС використовується кілька методів. Кожен має різний ступінь чутливості та специфічності, тому рекомендується поєднання. Цільове мікробіологічне дослідження калу показано пацієнтам з клінічною підозрою на ІРС. Навпаки, він не призначається пацієнтам із формованим стільцем і зазвичай не робиться дітям віком до 1-2 років.

Доказ антигену C. difficile

Глутаматдегідрогеназа (ГДГ) є специфічним антигеном - екзоферментом, що продукується усіма штамами C. difficile (токсигенними та нетоксигенними). Доказ антигену можливий безпосередньо зі стільцем, специфічність тесту становить 80 - 100%. Він має високе негативне прогнозне значення (NPV), т. j. негативний результат, швидше за все, виключає можливість зараження клостридіями. Однак тест не розрізняє токсигенних та нетоксигенних штамів. Його недоліком є ​​також можливість перехресної реакції з іншими видами Clostridium spp. присутній у фекаліях (хибнопозитивний результат у 20%). GDH може бути визначений окремо або в рамках тестів, які також виявляють токсини C. difficile.

Докази токсинів C. difficile (A/B)

Для виявлення А/В токсинів використовуються діагностичні набори, засновані на принципі імуноферментного аналізу або імунохроматографії. В даний час на ринку існує ряд комерційних наборів з різною чутливістю та специфікою. Їх перевага - доступність, швидкість, висока специфічність, проста конструкція з чіткою інтерпретацією доказів токсигенності штаму. Тест має високе позитивне прогнозне значення (PPV), т. j. позитивний результат, швидше за все, доводить клостридіальну інфекцію. Недоліком є ​​відносно низька чутливість (90%), що в деяких випадках призводить до помилково негативних результатів.

Анаеробне вирощування

Анаеробне вирощування C. difficile досить вимогливе і тривале (2-3 дні). Для обробітку використовують селективні ґрунти, що містять цефокситин та циклосерин, які пригнічують супутню флору. Підтвердження знахідки культури можливо мікроскопічно (орієнтаційно), біохімічно (за допомогою комерційних анаеротестів), за допомогою тесту на латексну аглютинацію або з використанням новіших методик (ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція, MALDI TOF MS - матрична допоміжна лазерна десорбційна іонізація-час польової мас-спектрометрії). Культуральний тест вважається необхідним для всіх зразків стільця, у яких підтверджена позитивність до GDH, включаючи токсинонегативні випорожнення. Імунохімічні аналізи або ПЛР можуть бути використані для виявлення токсинів із вирощеної культури. Перевагою обстеження культури є його високий урожай, можливість зберігання ізольованих культур, визначення чутливості до антибіотиків (ATB) або молекулярний типізація (епідеміологічні цілі).

Демонстрація цитотоксичності в культурах тканин

Докази цитотоксичності в культурах тканин мають досить історичне значення. Цей метод трудомісткий, лабораторне обладнання та досвід інтерпретації, його недоліком є ​​ризик помилкової позитивності. Повідомляється, що чутливість становить 94-100%. Цитотоксин можна виявити у фекаліях або з ізольованого штаму дифіцилу на культурах тканин фібробластів, де виникає цитопатичний ефект.

ПЛР - докази токсичності генів

Впровадження методів ПЛР, як скринінгових, так і підтверджуючих методів, у діагностику ІРС є європейською тенденцією. Вони характеризуються високою чутливістю (99 - 100%) і специфічністю, значно скорочуючи час отримання результату. Значення PPV парадоксально знижується, оскільки ПЛР є настільки чутливим, що навіть невелика кількість токсигенної C. difficile, присутньої при нормальній колонізації, може бути виявлена ​​у зразку, таким чином не відрізняючи колонізацію від інфекції (14). Сьогодні ми маємо комерційні набори (засновані на принципі ПЛР у реальному часі) для виявлення гена, що продукує токсин В, гена бінарного токсину, набори для виявлення делецій, типових для деяких епідемічних риботипів ПЛР (наприклад, 027, 176) . ПЛР є особливо важливою для перевірки важких форм ІРЗ та для підтвердження розмитих результатів попередніх тестів.

Набір тексту C. difficile для епідеміологічних цілей

До передових методів діагностики належать риботипування та токсинотипування, які засновані на ПЛР та аналізі макрорестрикції методом імпульсного гель-електрофорезу (2). Під час риботипування C. difficile область між генами 16S і 23S рРНК (так звана міжгенна спейсерна область) посилюється. Існує різниця між окремими риботипами в кількості алелей цих генів та в довжині ділянок між алелями (6). Кожна RT формує специфічний електрофоретичний профіль, відповідно до якого вона згодом ідентифікується. Щоб визначити конкретну RT, отримані електрофореограми порівнюють з австрійською веб-базою даних https://webribo.ages.at/. Загалом було виявлено понад 800 ПЛР-риботипів та 24 токсинотипи.

Рекомендована діагностична процедура

Матеріал та методологія

Передплата біологічний матеріал і транспорт до лабораторії Для мікробіологічного дослідження калу на наявність C. difficile слід зібрати мінімум 2 мл фекалій у стерильний контейнер. Стілець слід обробити та дослідити протягом двох годин, оскільки токсини відносно нестійкі, швидко розпадаються та можуть призвести до помилкового негативу. Якщо неможливо дослідити стілець відразу після забору, доцільно зберігати зразок при температурі в холодильнику (близько 5 ° C), тоді стабільність токсину забезпечується протягом 48 годин. Для тривалого зберігання зразків зразок калу слід глибоко заморозити при -70 ° C.

Результати

Всього протягом 5 місяців було обстежено 481 стілець з діареєю у 3 лікарнях. Огляд окремих відділів, з яких надходили досліджені зразки, подано в в таблиці 1. Із загальної кількості досліджених стільців 104 зразки ГДГ були позитивними (21,6%). Після вилучення невдало оброблених, продубльованих, відп. три зразки залишились у наборі з 66 зразків (66 пацієнтів). Ізоляти C. difficile із цих випорожнень піддавали молекулярному типізації. З 66 зразків 58 (87,9%) були токсигенними (присутні гени tcdA та tcdB), з яких 6 ізолятів також мали гени бінарних токсинів (cdtA, cdtB). Решта 8 зразків з набору (12,1%) були нетоксичними, тобто j. вони не продемонстрували присутності жодного з генів для вироблення токсинів. За допомогою триступеневого діагностичного алгоритму та комбінації інших методів (імунохроматографічне визначення токсинів та виявлення токсигенності методом ПЛР) було встановлено, що з 58 токсино-позитивних стільців, 35 зразків мали позитивний токсин безпосередньо зі стільцем та 23 зразки ( токсин-негативний від стільця) до токсигенної культури підтвердив позитивність токсинів (Таблиця 2).

Висновок