предметів

реферат

Дуже мало досліджень аналізували, як склад мікробіома матері впливає на розвиток кишкової та ротової мікрофлори немовлят протягом перших місяців життя. Тут мікробіоз, присутній у кишечнику матері, піхві, грудному молоці, ротовій порожнині та грудних венах, порівнювали з мікробіозом кишечника та ротової порожнини їхніх дітей протягом перших шести місяців після народження. Проби відбирали із зазначених ділянок тіла у семи матерів та дев'яти дітей у три різні моменти часу протягом 6 місяців. Кожен зразок аналізували шляхом секвенування гена 16S рРНК. Мікрофлора кишечника немовлят містила різні мікробні спільноти, які мало нагадували різні материнські мікрофлори. На відміну від цього, мікробіота у ротовій порожнині немовлят виявляла високу схожість з мікробіозом материнського молока, грудей та рота. Ці результати показують, що постійний контакт між мікробними спільнотами збільшує їх подібність. Більшість оперативних таксономічних одиниць у дитячому кишечнику та мікробіозі порожнини рота також були поширені з кишковою кишкою та ротовими спільнотами. Різниця між подібністю та часткою ОТУ, розподілених між кишковою мікрофлорою немовлят та матерів, може бути пов’язана з меншим різноманіттям і, отже, конкуренцією в мікрофлорі кишечника немовлят.

Отже, метою цього дослідження було порівняти вплив різних материнських мікробних спільнот - кишкового, вагінального, орального, грудного молока та молочної залози на розвиток кишкової та ротової мікрофлори немовлят протягом перших шести місяців немовлят. життя.

Матеріал і методи

Навчальна група та вибірка

Вагітні жінки були включені в це дослідження протягом першого періоду спонтанного початку пологів або до 24 годин до планового кесаревого розтину з неушкодженими амніотичними оболонками. Вони були зараховані до відділення жіночої консультації в Університетській лікарні Тарту з травня 2012 р. По вересень 2013 р. Всі визнані жінки мали неускладнену вагітність, не мали інфекційних захворювань, що вимагали лікування антибіотиками, і раніше не хворіли на діабет. або гіпертонічні розлади протягом другої половини вагітності. Загалом сім матерів (середній вік: 33,1 ± 4,5 року) були усиновлені разом із новонародженими (пари матері та дитини). Дві пари включали близнюків, і всі четверо дітей були включені в це дослідження. Лише одна жінка не була багатонародженою (середній парність, 1,4 ± 0,8). П'ять жінок народили за допомогою кесаревого розтину та отримували профілактичне лікування цефуроксимом перед надрізом на шкірі. Усі новонароджені були середніми (середній термін вагітності 38,9 ± 1,6 тижнів) та мали нормальну масу тіла при народженні (середня вага 3,379,3 ± 564,1 г). Клінічні фактори, що описують материнські та немовляти, перелічені в додаткових таблицях S1.

Шість типів зразків відбирали у кожної пари матерів та немовлят до народження або через 48-72 години після народження, через 6-8 тижнів та 6 місяців після народження. Крім того, у кожної матері перед пологами брали зразок вагінального мазка. Всього було взято 139 зразків (рис. 1). До відбору проб не застосовували вагінальних чи шкірних дезінфікуючих засобів, а також не чистили промивання грудей. Всі відібрані зразки зберігали при -20 ° C відразу після відбору проб.

розвиток

Кількість та тип зразків, відібраних у пар мати-дитина у кожний із зазначених часових моментів.

Повнорозмірне зображення

Бактеріоскопічні мазки робили з окремого зразка вагінального мазка, який відбирали у кожної матері перед пологами. Зразки фарбували за Грамом та оцінювали за методом Нугента 7: 0-3 (норма), 4-6 (проміжний продукт) та 7-10 (бактеріальний вагіноз (BV)).

Профілювання спільноти бактерій

ДНК витягували за допомогою набору для ізоляції ДНК MoBio PowerFecal (Mo Bio, Карлсбад, Каліфорнія) відповідно до інструкцій виробника. Однак для різних типів зразків були включені додаткові кроки. Коротко кажучи, усі зразки мазків спочатку вирвали протягом приблизно 10 хвилин у 750 мкл стерильного сольового розчину, забуференного фосфатом (PBS). 400 мкл зразків мазків у PBS та 800 мкл материнської води додавали в кожну суху трубочку. 1 мл материнського грудного молока спочатку центрифугували при 6000 об/хв протягом 20 хвилин. Супернатанти видаляли і кожну гранулу ресуспендували в 400 мкл PBS перед перенесенням в окремі пробірки з сухими кульками. Потім пробірки центрифугували при 13 200 об/хв протягом 30 хвилин. Супернатанти видаляли, а на етапі 2 дотримувались процедури для набору для ізоляції ДНК MoBio PowerFecal. ДНК із зразків калу витягували згідно з протоколом виробника. Зразки, що представляють один і той же тип мікробної спільноти, утворюють одну партію екстракції ДНК. Вилучену ДНК зберігали при -20 ° C перед аналізом.

Ампліфікацію гіперпроменливої ​​області V1-V2 16S рРНК проводили за допомогою штрих-кодів універсальних праймерів 27F-YM та 357 R 8. Послідовності праймерів були такими: 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNNNNNN AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3 '(Illumina TruSeq. 3-end adapter) і 5-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC TGC TGC CTY CCG TA-3 ′ (послідовність універсального адаптера TruSeq і 357 R на 3 ′ кінці). Умови посилення включали: 10 хвилин при 98 ° C, а потім 5 циклів по 30 с при 98 ° C, 30 с при 55 ° C і 45 с при 72 ° C, 30 циклів по 30 с при 98 ° C і 60 с при 72 ° C і остаточний крок видовження при 72 ° C протягом 10 хвилин.

Реакції ПЛР мали загальний об’єм 20 мкл, з 10 мкл Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA), 5 мкл матриці ДНК і кожен праймер у концентрації 0,2 мкМ. Продукти ПЛР очищали за допомогою Agencourt AMPure XP (Бекман Коултер, Бреа, Каліфорнія, США) та секвенували за допомогою системи Illumina MiSeq в Центрі геному в Університеті Тарту, Естонія (секвенування з одного кінця за допомогою набору MiSeq v2 та 300 циклів).

Аналіз біфідобактерій в режимі реального часу за допомогою DGGE та ПЛР проводили, використовуючи методологію, описану в додаткових методах.

Дані та статистичний аналіз

Програмне забезпечення MOTHUR 1.27.0 було використано для модифікації, послаблення та вирівнювання отриманих послідовностей для створення оперативних таксономічних одиниць (OTU) та призначення таксономій. Послідовності вирізали та викидали на основі показника якості 225 п.н. відповідно. OTU створювались із використанням середнього суміжного ієрархічного алгоритму кластеризації з порогом ідентичності 97%. Довідкові послідовності відповідних послідовностей генів 16S рРНК були отримані з бази даних рибосомної РНК SILVA, а порівняння з таксономічними призначеннями проведено за допомогою живого байєсівського класифікатора з межею довіри 90%. OTU з менш ніж двома послідовностями та OTU, присутні менш ніж у двох зразках, також були відкинуті. Щоб визначити найбільш вірогідну назву виду для основних OTU, зіставлених із родом Lactobacillus, було проведено ще одне таксономічне присвоєння базі даних послідовності рибосомної РНК NCBI 16S з BLASTN.

Всі аналізи проводили за допомогою корекції Холма-Бонферроні. Значення Р менше 0,05 вважали статистично значущими.

Етичні міркування

Це дослідження було схвалено Комітетом з питань етики досліджень при Університеті Тарту (№ 210T-7), і кожен учасник отримав письмову інформовану згоду після прийому до відділу доставки. Всі методи виконувались відповідно до діючих настанов та норм.

результат

Профілювання спільноти бактерій за допомогою секвенування 16S рРНК

Всього в цьому дослідженні було створено 1 106 448 високоякісних зчитувань послідовностей. Обмеження мінімальної кількості усічених послідовностей, призначених вибіркам, коливалося від 200 до 1400 залежно від типу спільноти (Додаткова таблиця S2). При цих межах криві розведення щонайменше 90% зразків досягали 5% плато. Загалом 135 з цих зразків та 1530 OTU перевищили ці граничні значення та були проаналізовані (номери приєднання GenBank для репрезентативних послідовностей OTU: KP117311-KP118840). Одне грудне молоко, одна пероральна проба матері та дві пероральні проби для немовлят не перевищували цих меж. Отримані ОТУ були розподілені між 12 штамами, 89 сімействами та 170 родами.

Найвищі значення індексу різноманітності Шеннона спостерігалися в кишечнику матері та мікробіозі ротової порожнини, і ці спільноти суттєво відрізнялись від кишечника та мікробіозу ротової порожнини немовлят, які мали значно меншу мікробну різноманітність (p

Графік кореляції, що представляє значення індексу схожості косинусів між аналізованими типами мікробних спільнот. Часові моменти представляють час вибірки щодо народження немовлят.

Повнорозмірне зображення

Неметричне багатовимірне масштабування (NMDS) наносить графік візуалізації відстані Жакара між зразками аналізованих типів мікробних спільнот.

Повнорозмірне зображення

Відносна кількість найважливіших ОТУ, що колонізували аналізовані типи громад.

Повнорозмірне зображення

Мікрофлора кишечника немовлят під час дослідження не поділяла жодної схожості з жодним з аналізованих типів материнського співтовариства, однак спостерігалася висока схожість між мікрофлорою ротової порожнини немовлят та мікробіозом, що колонізує грудне молоко, молочну залозу та порожнину рота. порожнини (рис. 2). Ці чотири типи спільнот містили комбінацію домінуючих ОТУ, що належать переважно до роду Streptococcus, які були присутні в кожній популяції з настільки ж високою відносною частотою (рис. 4). Виняток становили ОТУ, які наносили на карту роди Staphylococcus та Propionibacterium. Ці ОТУ мали низький відносний достаток (

Частка ОТУ, що спостерігається в кишкових агрегатах ( A ) та оральний ( B ) дитячих мікроорганізмів, спільних з материнськими типами. * Кишечник та мікробіоз немовлят у кожний аналізований момент часу порівнювали з вагінальним мікробіозом, який спостерігався у матерів перед пологами.

Повнорозмірне зображення

Середня частка з 95% довірчим інтервалом OTU, що спостерігається в кишечнику ( A ) немовлят і перорально ( B ) мікробіоз, який поділявся з типами спільноти його матері (спільний доступ між певними парами мати-дитина). * Кишечник та мікробіоз немовлят у кожний аналізований момент часу порівнювали з вагінальним мікробіозом, який спостерігався у матерів перед пологами.

Повнорозмірне зображення

Кишечник та мікробіоз немовлят не продемонстрували суттєво більшої схожості з мікробними спільнотами їхніх матерів, ніж мікробні спільноти інших матерів, і подібність істотно не змінилася під час дослідження (рис. 7 та додатковий малюнок S2).

Середній показник подібності між козами ( A ) та оральний ( B ) за мікробіозом та типами мікробних спільнот власної матері (червоні крапки) та типами спільноти, що спостерігаються у решти матерів (Tukey boxplot).

Повнорозмірне зображення

Немовлячий склад мікробіоти та немовляти

Підсилювальні ефекти також були значущими в мікрофлорі ротової порожнини немовлят під час дослідження (середнє відносне відчуження [0, 8] [0, 16]) (Додаткова фігура S3). На нижчих таксономічних рівнях переважали Streptococcaceae (0, 7 [0, 18]), а потім Pasteurellaceae (0, 08 [0, 09]). Оральна мікробіота немовлят була відносно стабільною протягом досліджуваного періоду (додатковий малюнок S6-C) і була дуже схожою у немовлят.

У цьому дослідженні мікробіоз кишечника та ротової порожнини близнюків у цьому дослідженні не виявив більшої подібності між цими парними братами та сестрами, ніж спостерігалося у інших дітей (середнє значення [SD] CSI: 0,35 [0,38 проти 0,32 [0,34] та 0,76 [0,24 ]). проти 0,75 [0,22] для мікрофлори кишечника та мікробіозу ротової порожнини між близнюками порівняно з іншими дітьми). Крім того, кишечник і мікрофлора порожнини рота у немовлят, народжених вагінально, проти кесаревого розтину не виявили більшої подібності (0,22 [0,16] проти 0,35 [0,38] та 0,8 [0,82 проти 0,73 [0,24].] Для мікробіотиків кишечника та ротової порожнини у дітей, народжених вагінально кесарів розтин).

Склад мікробних спільнот, що колонізують матерів

обговорення

Наскільки нам відомо, це одне з перших досліджень, що аналізує вплив мікробіозу матері на різні частини тіла на кишечник немовлят та мікробіоз порожнини рота. Виходячи з досліджених нами материнських і немовлят, мікробіоз немовлят містить сильну мікробіологічну спільноту, яка мало нагадує мікробіоз, який колонізує кишечник матері, вагінальну тканину, шкіру, грудне молоко та ротову порожнину протягом перших шести місяців життя. життя дитини. Навпаки, мікробіота ротової порожнини немовлят, а також мікробіоз материнського молока, мікробіоз молочної залози та мікробіоз ротової порожнини були дуже схожі між собою.

Висока кількість Streptococcus OTU, що спостерігається в громадах, що колонізують грудне молоко та рак молочної залози, а також велика кількість стафілококів та Propionibacterium, які є типовими колонізаторами людської шкіри 13, в мікробіомі грудного молока (додатковий малюнок S6) свідчить про те, що може відбуватися ретрограда. під час грудного вигодовування, як передбачали Ансікар та співавт. 9. Оскільки ареоли молочної залози не були очищені до відбору проб, дослідження може переоцінити подібність між мікроорганізмом порожнини рота у немовлят та мікробіозом, який колонізує ареоли грудей.

Порівняно з іншими матерями, ми не спостерігали більшої подібності мікробних спільнот між немовлятами та їхніми матерями (рис. 7). Це може здатися дивним, враховуючи те, що в кількох попередніх дослідженнях спостерігалася передача бактеріальних штамів від матері до дитини 9, 10, але, швидше за все, наші результати вказують на відсутність секвенування генів 16S рРНК при ідентифікації таксонів на нижчому рівні, ніж рід 14. Таким чином, наші результати аналізу складу спільнот на рівні штамів не виключають суттєвих подібностей між окремими парами матерів та немовлят (і відмінний характер спільноти від інших матерів).

Іншим обмеженням цього дослідження був малий обсяг вибірки, що, швидше за все, було причиною того, що ми не спостерігали впливу типу дозування та режиму годування на склад кишечника та мікробіонів у дітей. Ці ефекти добре описані в багатьох попередніх дослідженнях [наприклад, Список літератури 6, 10]. Однак найбільша кількість таксісів біфідобактерій спостерігалася в мікрофлорі кишечника у близнюків, які були на грудному вигодовуванні протягом коротших періодів і замість них отримували формулу пребіотиків. Цей результат узгоджується з дослідженням Barrett et al. 15, де найбільша кількість штамів біфідобактерій та їх різноманітність спостерігалися у немовлят, які отримували пребіотики формули (наприклад, галактоолігосахариди та поліфруктозу) 15. .

На закінчення було виявлено, що мікрофлора кишечника немовлят відрізняється від усіх типів материнської спільноти, проаналізованих у цьому дослідженні, тоді як мікробіота порожнини рота у немовлят виявила високу схожість з мікробіозом грудного молока та молочної залози. Ці результати підкреслюють значний вплив постійних контактів між цими мікробними спільнотами. Однак було встановлено, що як дитяча мікрофлора кишечника, так і ротової порожнини мають найвищу частку ОТУ з відповідним типом материнської спільноти. Різниця між подібністю та часткою ОТУ, яка спостерігається у мікрофлорі кишечника немовлят та матерів, може бути пов’язана з меншим видовим різноманіттям і, отже, меншою конкуренцією в мікрофлорі кишечника немовлят, що призводить до різниці в величині спільних ОТУ.,

Дякую

Ми вдячні Хайлі Варенді та Аннелі Аус з дитячої клінічної клініки Університету Тарту за технічну допомогу. Це дослідження підтримано Естонською науковою радою (гранти № IUT34-19 та IUT34-16), Міністерством освіти та досліджень Естонії (грант № KOGU-HUMB), Європейським Союзом через Європейський фонд регіонального розвитку (реєстр SFOS 3.2.0701.11-0023), Підприємство Естонія (грант № EU48695) та інноваційну програму Horizon 2020 (WIDENLIFE, EU692065). Яак Сімм фінансує Дослідницьку раду KU Leuven (GOA/10/09 MaNet, CoE PFV/10/016 SymBioSys) та гранти доктора наук/Postdoc від уряду Фламандії (IOF, Геркулесове зшивання, iMinds Medical Information Technologies SBO 2014). Фінансування також забезпечували Intel, Janssen Pharmaceutica та Фламандський інститут науки і техніки (IWT).

Електронний додатковий матеріал

Додаткова інформація

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.